圆齿野鸦椿醇提物抗肝癌作用研究△

黄维，邹小兴，丁卉，梁文贤，倪林，邹双全*

（1.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；2.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002；3.福建农林大学林学院，福建 福州 350002；4.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002）

圆齿野鸦椿Euscaphis konishii Hayata为省沽油科（Staphyleaceae）野鸦椿属 （Euscaphis）常绿小乔木［1-2］。在民间，圆齿野鸦椿的根、根皮、花、果实均可作药用，具有温中理气、抗炎镇痛、清热解毒、消肿散结等功效，常用来治疗胃痛、寒疝、泻痢、脱肛、子宫下垂、睾丸肿痛、跌打损伤等疾病［2-4］。目前，国内外对圆齿野鸦椿的研究主要集中在组织培养、种子发芽、栽培技术等方面［5-7］，而圆齿野鸦椿化学成分及其药理药效活性等研究尚属空白，相关的报道也仅是对同属植物野鸦椿的提取物在消炎、抗癌等方面的初步研究［8-10］。本研究通过制备圆齿野鸦椿不同部位的乙醇提取物，采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）和流式细胞术检测肝癌细胞凋亡的体外实验、小鼠肝癌H22移植瘤体内抑瘤实验，探讨圆齿野鸦椿不同部位提取物的抗肝癌效果，该研究可为今后对圆齿野鸦椿的深入研究奠定基础。

1 材料

1.1 植物

圆齿野鸦椿于2016年10月采自福建省邵武市天成岩，经福建农林大学邹双全教授鉴定为省沽油科野鸦椿属圆齿野鸦椿Euscaphis konishii Hayata。圆齿野鸦椿果实晒干后分离果皮和种子；取顶端去叶枝条，长度为40～50 cm；取顶端枝条上当年生叶片。

1.2 试剂

5-氟尿嘧啶（5-Fu）质量分数 ＞99%（sigma公司）。胎牛血清、RPMI1640培养液、DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶和0.01 mol·L-1PBS溶液（Hyclone公司）；四甲基偶氮唑盐 MTT（Amresco公司），Annexin V-FITC／PI双染细胞凋亡检测试剂盒（KGA106，江苏凯基生物技术股份有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）及其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器

RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），倒置显微镜（日本Olympus），二氧化碳培养箱（美国Thermo Forma），TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂），超净工作台（苏州博莱尔净化设备有限公司），酶标仪（美国BioTek），FACSC autoTMⅡ型流式细胞仪（美国BD）。

1.4 细胞株

HepG2、SMMC-7721和BEL-7404肝癌细胞，小鼠H22肝癌细胞株，均购自上海细胞微生物研究所。

1.5 动物

普通级昆明种小鼠，体重18～22 g，均为雄性小鼠，由福建医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（闽）2016-0007。

2 方法

2.1 圆齿野鸦椿醇提物的制备

取干燥的圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。加50 L体积分数为70%的乙醇加热至80℃回流提取2次，每次提取2 h，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子的醇提物。

2.2 细胞培养

HepG2、SMMC-7721和BEL-7404肝癌细胞培养条件为含有胎牛血清（体积分数为0.1）、青霉素（1×105IU·L-1）和链霉素（100 mg·L-1）的 RPMI 1640培养液，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

2.3 MTT法测定药物的半数抑制浓度

在96孔培养板上接种细胞，每孔接种量为5×103个细胞，每孔180μL，实验组分别加入不同浓度的药物，对照组不加药，另设空白孔组（只加培养基，无细胞），每组设3个平行孔，37℃培养至所需的时间，加入5 g·L-1的MTT溶液20μL／孔，继续培养4 h后，弃去上清液，加入150μL DMSO溶解，培养箱孵育20 min后，用酶标仪（Thermo公司）在570 nm波长下测吸光度值（A）。根据公式（1）计算细胞生长抑制率。

以同一药物的不同浓度对细胞生长抑制率作图，可得到剂量反应曲线，根据线性回归方程求出该药的半数抑制浓度IC50，即细胞存活率减少50%时的药物浓度。

2.4 流式细胞术测定细胞凋亡

取对数生长期的HepG2细胞，用200μg·mL-1果皮、叶片、枝条和种子的乙醇提取物处理细胞48 h后，调整密度为1～5×105mL-1细胞悬液，用PBS洗2遍，再将细胞重悬于Binding Buffer悬浮细胞。设置阴性对照和两个单染对照。阴性对照为对照组细胞不加染料，两个单染对照为阳性药物处理过的细胞只加入5μL Annexin V-FITC或5μL PI。测试组细胞加入 Annexin V-FITC混匀后，再加入5μL PI混匀，室温、避光、反应5～15 min。在1 h内，进行流式细胞仪的检测。流式细胞仪采集的荧光强度用自带的软件进行数据处理。

2.5 小鼠肝癌H22移植瘤模型的建立

接种H22瘤种腹腔传代6～8 d后，腹部隆起明显，将腹水瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下从腹腔抽出瘤液，用0.9%氯化钠注射液稀释至1×107个·mL-1，采用该浓度肿瘤细胞悬液对实验小鼠右腋进行皮下接种，接种量为0.2 mL／只，构建小鼠肝癌H22移植瘤模型。

2.6 动物分组和给药

接种24 h后，将小鼠随机分为6组，每组10只。模型组灌胃给予0.9%氯化钠注射液，阳性组给予5-Fu 20 mg·kg-1，给药组分别给予圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子的醇提物200 mg·kg-1，用0.9%氯化钠注射液配成混悬液进行给药，每天1次，连续给药14 d。

2.7 组织样品的收集与处理

末次给药24 h后称小鼠体质量，颈椎脱臼处死动物，剥离瘤块，剖取胸腺、脾脏，用滤纸吸干后称重并记录。分别按公式（2）（3）（4）计算各组的肿瘤抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数。

2.8 统计学处理

采用SPSS22.0软件进行统计学分析，实验结果以（¯x±s）表示，多组间比较采用完全随机设计方差分析（ANOVA），组间比较采用 LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 圆齿野鸦椿各部位的醇提物的制备

圆齿野鸦椿果皮、叶片、枝条和种子经过烘干粉碎后，各取10 kg样品采用70%乙醇回流提取2次，提取液过滤后，减压浓缩分别得到圆齿野鸦椿果皮、叶片、枝条和种子的醇提物2.65、2.37、2.42、2.25 kg。

3.2 圆齿野鸦椿各部位的醇提物对肝癌细胞增殖的抑制

取上述圆齿野鸦椿果皮、叶片、枝条和种子醇提物，以 DMSO配制，分别处理 HepG2、SMMC-7721和BEL-7404肝癌细胞48 h，用 MTT法检测上述醇提物对肝癌细胞增殖的影响，以同一药物的不同浓度对细胞生长抑制率做图，得到剂量反应曲线，根据线性回归方程求出该药的半数抑制浓度IC50，即细胞存活率减少50%时的药物浓度。果皮醇提物、枝条醇提物、叶片醇提物和种子醇提物对 HepG2、SMMC-7721和 BEL-7404的IC50见表1。结果表明，圆齿野鸦椿各提取物对肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7404均有明显的增殖抑制作用，其中果皮提取物的抑制作用最为明显。

表1 圆齿野鸦椿各部位醇提物对HepG2、SMMC-7721和BEL-7404细胞的IC50（¯x±s，n＝3）μg·mL-1

3.3 圆齿野鸦椿各部位醇提物对HepG2细胞凋亡诱导作用

200μg·mL-1圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子的乙醇提取物处理 HepG2细胞48 h，以20μg·mL-15-Fu为阳性对照，用流式细胞仪检测，果皮、枝条、叶片和种子醇提物诱导的HepG2细胞早期凋亡率分别为 10.27%、9.73%、9.35%、8.63%，晚期凋亡率分别为 9.55%、8.94%、6.73%、5.27%，与空白对照组相比，均可显著引起HepG2细胞凋亡（P＜0.05，见图1和表2），而果皮提取的凋亡诱导效果最好。

图1 圆齿野鸦椿各部位醇提物对HepG2细胞凋亡的影响

表2 200μg·m L-1圆齿野鸦椿各部位醇提物对HepG2细胞凋亡诱导作用（±s，n＝3）

表2 200μg·m L-1圆齿野鸦椿各部位醇提物对HepG2细胞凋亡诱导作用（±s，n＝3）

注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

表3 圆齿野鸦椿各部位醇提物对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用（¯x±s，n＝10）

3.4 圆齿野鸦椿各部位醇提物对小鼠肝癌H22移植瘤体内抑瘤效果的研究

用小鼠肝癌H22移植瘤模型来考察圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子的乙醇提取物的体内抗肿瘤活性。取圆齿野鸦椿各部分提取物200 mg·kg-1，对肝癌H22移植瘤小鼠连续灌胃给药14 d，以5-Fu 20mg·kg-1为阳性对照，以0.9%氯化钠注射液给模型组，于第15 d称体重，颈椎脱臼处死动物，剥离瘤块，计算圆齿野鸦椿各部分醇提物的抑瘤率。

表3、图2结果显示，圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子的乙醇提取物200 mg·kg-1连续灌胃给药14 d，对肝癌H22移植瘤小鼠瘤块增殖的抑制率可分别达到47.8%、44.9%、42.5%和40.6%，显示了良好的体内抗肝癌活性。

图2 圆齿野鸦椿各部位醇提物对小鼠肝癌H22移植瘤生长的作用效果

3.5 圆齿野鸦椿各部位醇提物对H22小鼠免疫器官的影响

5-Fu组小鼠胸腺指数和脾脏指数均明显小于正常组和模型组（P＜0.01），而圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子醇提物给药组小鼠的胸腺指数与正常组和模型组相比，有明显的提高（P＜0.05），而对脾脏指数无影响（P＞0.05，见表4），说明圆齿野鸦椿各部分醇提物对荷瘤小鼠具有一定的免疫增强作用。

表4 圆齿野鸦椿各部位醇提物对H22小鼠免疫器官的影响（¯x±s，n＝10）

4 讨论

肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一，我国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51%，严峻的形势对国人的健康和社会经济带来严峻的挑战。采用化学合成药物来治疗癌症，疗效显著，但是具有较高的毒副作用，容易产生耐药性，且停药后有 “反跳”现象，治疗效果有限。中药作为天然产物，具有不良反应小、遗传毒性低等优点。因此，中药抗癌药物的研发一直受到关注。野鸦椿属植物野鸦椿在消炎和抗癌方面有显著的体外疗效［13-16］，但目前尚未有圆齿野鸦椿抗肝癌研究的报道。

本研究通过制备圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子的乙醇提取物，通过MTT法检测这4种醇提物对3株人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7404有不同程度的增殖抑制作用，其中果皮醇提物的抑制效果最强，对上述3株肝癌细胞作用48 h的半数抑制浓度分别为108.34、106.94、114.79μg·mL-1。我们进一步观察了圆齿野鸦椿不同部位醇提物诱导HepG2细胞凋亡的效果，结果显示，当这4种醇提物浓度为200μg·mL-1处理HepG2细胞48 h后，均可显著引起HepG2细胞的凋亡，其中果皮醇提物的活性最好。在体内活性检测中，圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子的乙醇提取物200 mg·kg-1对小鼠肝癌H22移植瘤小鼠瘤块增殖的抑制率分别达到47.8%、44.9%、42.5%和40.6%，显示了良好的体内抗肝癌活性。同时，对H22移植瘤小鼠进行解剖时发现，圆齿野鸦椿醇提物处理的H22小鼠肿瘤浸润范围较小，瘤块较易剥离，而与传统的化疗药5-Fu相比，圆齿野鸦椿醇提物的抑制肿瘤生长作用虽有所不及，但对荷瘤小鼠的体重影响较小，各部位醇提物给药组的胸腺指数均高于正常组和模型组，且差异有统计学意义（P＜0.05），说明圆齿野鸦椿醇提物具有明显的抗肝癌活性，可以提高肿瘤小鼠的免疫功能，值得深入研究其抗肿瘤的成分或有效组分。

［1］ 方文培.中国植物志：第46卷［M］.北京：科学出版社，1981：23-24.

［2］ 福建植物志编写组.福建植物志：第3卷［M］.福州：福建科学技术出版社，1985：296-297.

［3］ 福建中医研究所中药研究室.福建民间中草药：第四集［M］.福州：福建人民出版社，1959：349.

［4］ 福建省医药研究所.福建药物志：第一册［M］.福州：福建人民出版社，1979：294-295.

［5］ 覃嘉佳，龙云英.圆齿野鸦椿扦插繁殖技术［J］.林业科技开发，2007，21（3）：71-73.

［6］ 梁文英.圆齿野鸦椿播种育苗技术［J］.福建林学院学报，2010，30（1）：73-76.

［7］ 何碧珠，何官榕，邹双全.圆齿野鸦椿叶片的植株再生及快速繁殖［J］.福建农林大学学报（自然科学版），2010，39（3）：257-262.

［8］ 董玫，张秋霞，广田满.野鸦椿酯类化合物抗炎症活性与结构的研究［J］.天然产物研究与开发，2004，16（4）：290-293.

［9］ 左敏，倪志字，许立，等.野鸦椿对HeLa细胞的抗增殖作用及其机制的初步研究［J］.癌变·畸变·突变，2008，22（5）：350-353.

［10］李先辉，李春艳，贾薇，等.野鸭椿提取物抗炎镇痛效应研究［J］.时珍国医国药，2009，20（8）：2041-2042.