大口黑鲈组织蛋白酶B基因SNP筛选及其与生长性状关联分析

李胜杰，周春龙，白俊杰,，吴建开，樊佳佳，费志平，孙建国，马冬梅

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室， 广州 510380；2.南京帅丰饲料有限公司，南京 211306；3.湖州湖旺水产种业有限公司，浙江湖州 313000；4.淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，武汉 430070)

组织蛋白酶(Cathepsin)属于木瓜蛋白酶超家族半胱氨酸蛋白酶，具有蛋白质的加工、修饰和调控应答等生物学功能。Cathepsin B(CTSB)是最早被关注的组织蛋白酶[1]，该酶可降解肌球蛋白，且对肌动蛋白的降解能力要小于肌球蛋白。花腹鲭(Scomberaustralasicus)CTSB对肌原纤维蛋白产生明显降解作用[2]。CTSB基因参与细胞凋亡的发生[2-3]。CTSB基因在猪(Susscrofa)前体脂肪细胞分化过程中发挥调控作用，提高CTSB的表达，能促进猪前体脂肪细胞分化[4]。CTSB基因的突变对肉质和生长性状产生影响作用，如猪CTSB基因多态性与背膘厚显著和日增重存在相关[5]，牛(BosTaurus)CTSB基因内含子中的SNP位点与其体重和牛肉大理石纹性状密切相关[6]。目前对于鱼类CTSB的功能研究方面，鲢[7-8](Hypophthalmichthysmolitrix)、蓝圆鲹(Decapterusmaruadsi)[9]和松江鲈[10](Trachidermusfasciatus)等鱼类的CTSB基因序列已被克隆分离得到，且其活性得到证实，但关于鱼类CTSB基因多态性与生长性状的相关性研究还未见报道。

大口黑鲈(Micropterussalmoides)原产于美国和加拿大，1983年被引进到我国大陆进行养殖，现已成为国内的名优淡水经济养殖品种之一[11-12]。鉴于CTSB基因是影响生长性状的重要候选基因[13]，本研究从大口黑鲈CTSB基因中筛选SNP位点，并分析SNP位点与生长性状的相关性，为大口黑鲈分子标记辅助育种提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验用的20尾大口黑鲈采自珠江水产研究所广州水产良种基地，剪取每尾鱼尾鳍，在-20 ℃条件下无水乙醇中保存，用于后续SNP位点的筛选。用于生长关联分析的大口黑鲈采自佛山市南海区九江镇金汇农场。选择500尾亲鱼群体繁殖，将同一天收集的约100万受精卵孵化出的鱼苗转入池塘中进行培育，将培育的大规格鱼种放入面积为5 336 m2的池塘中喂养至成鱼，8月龄时，从养殖群体中随机挑选165尾，测量每尾鱼的体质量、全长、体长、体高、尾柄长和尾柄高等性状值，并剪取尾鳍于-20 ℃条件下无水乙醇中保存。

1.2 SNP位点筛查

采用组织DNA提取试剂盒(广州欣研生物科技有限公司)提取鳍条DNA。根据文献[14]中CTSB基因(GenBank：KJ160497)序列设计扩增引物，正反向引物序列分别为 5′-ACACTAAAAGCTCCCTCCACT-3′和5′- GCCAAGGTTAGCGTAGAGAT-3′，引物由广州吉格生物科技有限公司合成。PCR扩增程序的参数设置为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s， 72 ℃ 90 s，共32个循环；72 ℃ 7 min。扩增产物于4 ℃条件下保存。PCR产物经电泳检测符合预期条带后由上海博尚生物技术有限公司进行序列测定，采用Vector NTI软件比对分析序列并筛选SNP标记。

1.3 SNP位点的基因型分析

将提取的鳍条组织DNA和已获得的SNP位点相关信息送往上海捷瑞生物工程有限公司进行SnaPshot分型，具体流程如下：根据目标 SNPs 侧翼序列设计扩增引物(P1：5′-TGAGTCATATGAAAGCATTAC-3′和P2：5′-ACACTTTGTGTATGCAGGCTG-3′)，然后对每个样品的DNA进行PCR扩增。PCR扩增后取3 μL PCR产物用ExoI和FastAP纯化，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的DNTP，37 ℃条件下15 min，80 ℃高温灭活ExoI和FastAP酶15 min。根据ABI公司提供的SnaPshot试剂盒，用延伸引物进行延伸反应，使用ABI公司的PRISM 3730测序仪进行基因分型。

1.4 数据统计分析

遗传参数用POPGENE32软件计算。采用SPSS17软件中一般线性模型分析SNP位点与生长性状的相关性，统计分析模型采用Yij=μ+Gi+eij，Yij为某个性状第i个标记第j个个体表型值；μ为统计分析中所有个体的平均表型值；Gi为SNP标记的效应值；eij为对应于表型值的随机残差效应值[15]。

2 结果与分析

2.1 大口黑鲈CTSB基因序列和SNP位点筛查

PCR扩增后获得的目的片段约为1 390 bp，经测序和比对确认扩增片段为大口黑鲈CTSB基因序列。该基因包含3个内含子和4个外显子，编码区序列由990个碱基组成，共编码330个氨基酸。将20个样品的序列进行比对分析，在外显子3上筛选到一个G/C突变位点，依据其所在序列中的位置和碱基类型命名为C+598G。

将大口黑鲈CTSB基因编码区序列与GeneBank中已登录的鱼类CTSB基因进行比较，与条石鲷(Oplegnathusfasciatus，HM060314.1)的同源性最高，其核苷酸同源性为91%，与金头鲷(Sparusaurata，KJ524457.1)、许氏平鲉(Sebastesschlegelii，AB490961.1)、点带石斑鱼(Epinepheluscoioides，KC832926.1)、伯氏朴丽鱼(Haplochromisburtoni，XM_005915065.1)、牙鲆(Paralichthysolivaceus，AY686604.1)、青鳉(Oryziaslatipes，XM_020699636.1)、秀美花鳉(PoeciliaFormosa，XM_007549749.2)和弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris，XM_020938756.1)的核苷酸同源性分别为89%、88%、87%、86%、84%、84%和81%。C+598G突变位点除大口黑鲈具有G和C两种碱基外，其他鱼类在该位点的碱基均为G(图1)，该碱基的突变使原来编码甘氨酸的GGT突变为精氨酸的密码子CGT，甘氨酸属中性氨基酸，而精氨酸属于碱性氨基酸。

图1 不同鱼类中C+598G突变位点附近序列的比对(C+598G位点处所比对的碱基采用方框标记)Fig.1 The sequence alignment among different fishes for sequence nearby C+598G mutation site(the basic group compared in C+598 site was labeled by oblong box )

2.2 SNP位点在群体中的遗传结构分析

采用SnaPshot分型方法分析C+598G位点在165尾大口黑鲈个体中的基因型，统计分析结果显示，C等位基因的频率为64.24%，G等位基因的频率为35.76%，3种基因型GG、GC、CC的频率分别为40.6%、47.3%和12.1%。该位点的观测杂合度度(Ho)、期望杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)分别为0.473、0.461和1.85。经哈代-温伯格平衡卡方检验，该位点符合哈代-温伯格平衡定律(P>0.05)。C+598G位点的多态信息含量(PIC)为0.354，当PIC值介于0.25～0.5时被认为属于中度多态性[16-17]。

2.3 C+598G位点与生长性状关联分析

C+598G位点3种基因型与生长性状的相关性分析结果见表1，3种基因型个体在体质量、全长、体长、体高、尾柄长和尾柄高等6个性状上的平均值大小关系分别为：CC型>CG型>GG型，其中CC型与GG型在体质量上存在显著差异(P<0.05)，CC型个体的平均体质量比GG型个体增重66.68g，提高了15.31%。

注：表中数值为平均值±标准误差，同一列不同上标字母表示差异显著(P<0.05)

3 讨论

组织蛋白酶B是动物体内重要的内源蛋白酶，属于木瓜蛋白酶超家族的半胱氨酸蛋白酶[18]。CTSB基因对许多生理过程均具有调节作用。本研究将大口黑鲈CTSB基因的编码区序列与条石鲷等多种鱼类的CTSB 基因编码区序列进行比对，发现大口黑鲈CTSB基因核苷酸序列与这些鱼类序列之间的同源性在81%到91%之间，具有较高的同源性，说明CTSB这类木瓜蛋白酶家族在鱼类的进化上也与其他物种一样具有很高的保守性，受到高度的进化限制，发挥重要的生理生化功能。

Russo等[5]在猪CTSB基因内含子上筛选到3个SNP位点，邓桂馨等[6]在黄牛CTSB基因内含子6中筛选到1个SNP位点，而本研究首次在大口黑鲈CTSB基因外显子上筛选到1个SNP位点，对该位点在165尾大口黑鲈养殖样本中的基因型进行统计分析，CC、GC和GG型个体数分别为67、78 和20尾，其中GC杂合子占到47.3%，这可能与群体本身具有较丰富的遗传多样性有关。等位基因频率分析结果表明，C等位基因频率为64.2%，属于有利基因，且CC型对生长性状呈正相关，在生产应用中，通过人工定向选择基因型为CC纯合子的亲本，培育纯合子品系，从而实现优势基因型的快速富集。

已有研究表明，猪和牛CTSB基因存在SNP位点，且SNP位点与背膘厚、日增重和净肉重显著相关[5-6]。本研究结果表明，CTSB基因C+598G位点的CC型个体在体质量、全长、体高等多个生长性状上明显优于 GG型个体，其中CC型与GG型在体质量上存在显著差异，表明CTSB基因的多态性对大口黑鲈生长性状也产生影响作用。我们推测这是由于基因的单核苷酸突变，使原来编码的甘氨酸突变为精氨酸，甘氨酸与精氨酸的物理性质有所不同，前者是中性氨基酸而精氨酸为碱性氨基酸，这种变化可能导致其编码蛋白的结构产生变化，进而影响了蛋白的功能。这种由于一个编码碱基的突变改变了氨基酸的种类而使性状发生了明显改变，可作为高效的分子标记应用于分子育种，如皮尔蒙特牛和比利时蓝牛肌肉生长抑素(myostatin)基因的G/A转换，引起氨基酸由半胱氨酸转换为酪氨酸，该突变使牛表现出双肌性状并使产肉量提高[19]。

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