清肺抑火中药干预大气PM2.5对大鼠肺部炎症损伤的实验研究

杨莹莹　刘洁　蒋蓉芳等

摘要：目的 探讨中药清肺抑火中药对PM2，致大鼠肺部炎症损伤的干预作用。方法 将42只健康成年Wistar雄性大鼠随机分为7组，分别为空白对照组、生理盐水对照组、干预对照组、染毒对照组、低剂量干预组、中剂量干预组和高剂量干预组。处理结束后，收集各组大鼠肺泡灌洗液（BALF），并测定BALF中生化指标和炎症因子水平的变化。结果 与生理盐水对照组比较，染毒对照组BALF中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、乳酸脱氢酶（LDH）的活力和总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、超敏C反应蛋白（HS-CRP）含量均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。低、中、高劑量干预组BALF中生化指标和炎症因子水平比染毒对照组水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 清肺抑火中药可能通过抗细胞毒性和抗炎症作用，减轻PM_2.5暴露对大鼠肺部产生的损伤。

关键词：PM_2.5；中药；干预 中图分类号：R114 文献标志码：A

世界卫生组织（WHO）报道大气颗粒物污染造成全球1%的心肺系统疾病和3%的气管、支气管疾病及肺癌，每年导致约60万居民早死和740万失能调整生命年（disabilily adjusted of lire years，DALY）的损失。由于PM_2.5粒径小，表面积大，吸附有更多微小的有害物质，可通过呼吸到达肺泡并沉积在肺泡，甚至可以通过气血屏障随血液到达其他器官，对机体造成严重的损伤。研究表明，PM_2.5暴露与呼吸系统疾病的发生有明显的相关性，如肺功能降低、哮喘发作、支气管炎症以及肺癌等。目前认为炎症损伤和氧化应激损伤是PM_2.5对呼吸系统致病的主要机制，主要表现为PM_2.5进入机体后，通过多种途径刺激炎性细胞释放大量炎症因子，诱发剧烈的炎症反应，过多的炎症因子本身所具有的机体破坏性对肺部正常组织或细胞造成损伤，引起肺部组织增生和纤维化，最终导致机体、肺部疾病的发生。为减小PM_2.5暴露对机体的损伤，研究者一直试图寻找安全、有效拮抗PM_2.5对机体损伤的物质，如口罩、空气净化器、保健品（维生素C、维生素E、深海鱼油等）。已有不少天然物质引入干预PM_2.5对机体损伤的研究，如具有抗炎、抗氧化作用的黑巧克力、番茄红素、人参皂苷Rgl等。清肺抑火方剂来源于中医古方《寿世保元》，是一种由抗炎和抗氧化的天然药物制成的复方中药制剂，包含黄芩、栀子、天花粉、知母、大黄、黄柏、前胡、苦参和桔梗九味中药，具有清肺止咳、降火生津的功效。本研究以气管滴注PM_2.5混悬液染毒大鼠造成的肺部炎症损伤为模型，在PM_2.5染毒后给予清肺抑火中药干预，观察大鼠肺泡灌洗液中生化指标和炎症指标的水平变化，探讨清肺抑火中药对PM_2.5染毒所致大鼠肺部炎症损伤的干预作用。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Thermo Anderson G-2.5大流量采样器为美国Thermo Fisher公司产品，紫外可见分光光度计为上海习仁科学仪器有限公司产品，MK3酶联免疫检测仪为广州DENLEY公司产品，LGJ-10D冷冻真空干燥机为北京四环科学仪器有限公司产品，JL-180H超声波清洗机购自南京科捷分析仪器有限公司，玻璃纤维滤膜购自河北省故城县环境检测器材厂。酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、乳酸脱氢酶（LDH）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）标准比色试剂盒购自南京建成生物工程研究所。超敏C反应蛋白（HS-CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）ELISA试剂盒购自美国EBIOSCIENCE公司。中性福尔马林固定液、二甲苯、石蜡、苏木精染液、1%伊红酒精溶液、1%盐酸酒精溶液、95%乙醇、无水乙醇、中性树胶购自国药集团。

1.2PM_2.5采集与处理

于上海市某居住区[附近无工业企业，周围人口较密集，采样期间监测PM_2.5浓度值为（39.95±22.33）μg/m³]，用大流量采样器（采样高度为16 m）采集大气PM_2.5于玻璃纤维滤膜（孔径2.5μm）上。将载有PM_2.5的玻璃纤维滤膜去掉边缘部分，裁剪为1 cm×3 cm大小，放入锥形瓶，浸入超纯水中，低温超声震荡30 min×3次，将PM_2.5洗脱。6层纱布置于漏斗上，用于过滤PM_2.5震荡液，滤液真空冷冻干燥，收集PM_2.5颗粒放于4℃冰箱中保存备用。临用前，取一定量的PM_2.5颗粒物和0.9%生理盐水制成浓度为8.89 mg/mL的PM_2.5混悬液（本研究中PM_2.5染毒剂量为40 mg/kg体重，每次给予PM_2.5生理盐水混悬液的体积为4.5mL/kg，则所需配制的PM_2.5混悬液浓度为40mg/kg÷4.5 mL/kg=8.89 mg/mL，以体重计），超声震荡10 min混匀灭菌，4℃保存。

1.3实验动物分组及处理

SPF级Wistar雄性大鼠42只，体重180～200 g，购于上海西普尔一毕凯实验动物有限公司，合格证号：2008001641248。复旦大学伦理委员批准本实验，批准号：20150652C002。动物购入后，在动物饲养室分笼饲养，每笼3～4只，饲养室温度18～22℃，相对湿度45%～55%，12 h昼夜交替。适应性饲养2 d后，随机分为7组，每组6只。清肺抑火胶囊去外壳，将内容物黄芩等九味中药制成的粉末用浓度为0.2%的羧甲基纤维素溶液制成低、中、高浓度的混悬液。各组动物处理如下：空白对照组每天灌胃给予相应剂量以体重计（下同）为10 ml/kg 0.2%羧甲基纤维素溶液，持续1周；生理盐水对照组气管滴注1.5 mL/kg的生理盐水，隔天1次，共1周；干预对照组每天灌胃给与0.66 g/kg的清肺抑火中药混悬液1次，给药1周；染毒对照组气管滴注40 mg/kg的PM_2.5生理盐水混悬液染毒，隔天1次，共3次；低、中、高剂量干预组在实验第1周气管滴注40 mg/kg的PM_2.5生理盐水混悬液染毒，隔天1次，共3次，实验第2周开始每天灌胃依次给予0.07/kg、0.33/kg和0.66g/kg清肺抑火中药混悬液1次，共7次。

1.4大鼠一般体征观察

研究开始时、第1周结束时和第2周结束时均测量并记录每只大鼠体重，并在研究期间观察各大鼠总体活动情况及呼吸状况等指标。

1.5肺泡灌洗液提取与分析

于所有处理结束后24 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，剂量为3 mL/kg。称重后，腹主动脉取血。用手术剪刀打开胸腔，止血钳夹住一侧肺叶，另一侧用37℃预温的生理盐水灌洗3～4次，收集支气管肺泡灌洗液（broehoalveolar lavage fluid，BALF）。将提取的BALF经4℃、3000 r/min（1006×g）冷冻离心20 min。離心后的沉淀细胞悬液制作涂片，用瑞士一吉姆萨复合染色，光学显微镜下进行细胞分类计数。取离心上清液，分装放在冻存管中，于-80%冰箱保存。采用相应的试剂盒测定大鼠BALF中的酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、乳酸脱氢酶（LDH）的活力和总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）；用ELISA试剂盒检测细胞因子白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和超敏C反应蛋白（HS-CRP）水平，测定过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.6统计学方法

采用Excel 2003建立数据库，SPSS 22.0软件进行统计分析，所有数据均以x±s表示。两独立样本均数比较用studentstest进行检验；多组独立样本均数比较用单因素方差分析（One-Way ANO-VA），应用最小显著差法（Least significant differ-ence，LSD）进行组间两两比较，应用Levene法检验独立样本间的方差齐性，检验水准为0.05。

2结果

2.1大鼠一般体征变化

实验期间未见大鼠死亡。空白对照组、生理盐水对照组和干预对照组大鼠活动未见异常。染毒对照组大鼠PM_2.5染毒后出现呼吸急促、腹式呼吸幅度增加的症状，细听可闻及哮鸣音，总体活动量减少。低、中、高剂量干预组大鼠用清肺抑火中药干预后，呼吸急促有缓解，哮鸣音和腹式呼吸减少。干预对照组、生理盐水对照组与空白对照组大鼠的体重正常增长，且实验开始第1周（动物饲养第3天）、第2周（动物饲养第17天）结束时，3组体重差异无统计学意义。染毒对照组和低、中、高剂量干预组在第1周染毒、第2周干预结束时的体重均显著低于生理盐水对照组（P<0.05）。见表1。

2.2 BALF中细胞分类计数和肺体比

与空白对照组比较，干预对照组、生理盐水对照组大鼠BALF中的中性粒细胞百分比、肺体比均无显著性差异。与生理盐水对照组相比，染毒对照组大鼠BALF中的中性粒细胞百分比、肺体比均显著升高（P<0.05）。与染毒对照组相比，低、中、高剂量干预组的中性粒细胞百分比均呈药物剂量依赖性降低，差异亦有统计学意义（P<0.05）。各组大鼠肺泡灌洗液中的淋巴细胞百分比差异无统计学意义。与空白对照组比较，干预对照组、生理盐水对照组大鼠肺体比差异均无统计学意义。与生理盐水对照组比较，染毒对照组和低、中、高剂量干预组肺体比差异均有统计学意义（P<0.05）。低剂量干预组较染毒对照组的肺体比显著性降低（P<0.05）。见表2。

2.3 BALF中各生化指标测定

本实验通过对细胞毒性指标ACP、AKP、LDH活力和TP、ALB含量的测定，观察各组动物的肺部细胞和肺泡-毛细血管屏障损伤情况。干预对照组、生理盐水对照组与空白对照组比较，BALF中的ACP、AKP、LDH活力和TP、ALB含量差异均无统计学意义。与生理盐水对照组比较，染毒对照组大鼠BALF中ACP、AKP、LDH活力和TP、ALB含量均显著升高（P<0.05）。与染毒对照组比较，低、中、高剂量干预组大鼠BALF中的生化指标含量均呈药物剂量依赖性降低。见表3。

2.4 BALF中炎症损伤指标测定

本实验通过对各组大鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-ot、HS-CRP和IL-1β因子的测试，观察各组动物的机体炎性损伤情况。干预对照组、生理盐水对照组与空白对照组比较，BALF中的IL-6、TNF-α、HS-CRP和IL-1β浓度差异均无统计学意义。与生理盐水对照组比较，染毒对照组大鼠BALF中IL-6、TNF-α、HS-CRP和IL-1β浓度均显著升高（P<0.05）。与染毒对照组比较，低、中、高剂量干预组大鼠BALF中的IL-6、TNF-α、HS-CRP和IL-1β水平呈药物剂量依赖性降低。见表4。

3讨论

清肺抑火胶囊中多味中药具有免疫抑制、抗炎和抗氧化的作用。黄芩的提取物对羟自由基、烷自由基等具有较强的清除功能，可提高肾组织中GSH、SOD的活性，具有抗肾组织纤维化的作用。栀子提取物可降低LPS诱导的大鼠脑胶质瘤细胞中TNF-α、IL-1β、细胞活性氧含量和NF-KB活性，具有一定的抗炎作用。天花粉可抗炎、抗病毒、降血糖。知母提取物可提高小鼠脑组织中抗氧化酶SOD活性，发挥抗氧化、抗衰老的作用，还可减少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的合成，阻断NF-KB的生成，具有抗炎作用。大黄可抑制大鼠体内炎症因子的激活与释放，具有明显的抗炎作用。黄柏具有免疫抑制、抗炎和清除氧自由基的抗氧化作用。前胡具有舒张肺动脉高压，改善心脏舒张功能，降低大脑动脉梗死大鼠血清中炎性细胞因子水平和抗肿瘤等功效。苦参的有效成分苦参碱可影响炎症调节因子的水平，具有抗炎作用。桔梗具有祛痰镇咳、清除氧自由基的抗氧化作用。

动物体重增长状况可客观地反映动物的生长发育和新陈代谢功能，可以作为PM_2.5暴露对动物健康影响的一项宏观指标。本研究中，PM_2.5染毒导致大鼠体重增长低于正常水平，与用打印机墨盒内颗粒物染毒小鼠的研究结果相似。可能原因为，PM_2.5染毒引起大鼠机体炎症反应等多种不适，导致食欲下降，同时大鼠自身要修复机体的损伤，需要消耗更多的能量和营养物质，最终影响大鼠的正常生长发育。

研究表明，颗粒物随呼吸进入呼吸道和肺部以后，可通过氧化应激或炎症损伤等机制破坏肺泡腔血管基底膜和毛细血管膜结构，改变肺泡细胞膜形态结构和功能，增加细胞膜通透性，导致细胞内各种蛋白酶等内容物漏出。ACP是一种主要存在于巨噬细胞的溶酶体酶，可参与机体的防御反应，当巨噬细胞吞噬异物裂解死亡后，就会有大量的ACP从巨噬细胞释放到肺泡灌洗液中。AKP主要由肺泡Ⅱ型细胞产生，其含量多少提示肺泡Ⅱ型细胞受损程度。LDH是一种广泛存在于机体各组织细胞中的胞浆酶，肺泡腔内的LDH主要来源于肺泡细胞损伤后渗漏和血液渗漏，肺泡腔内LDH水平可反映肺组织细胞膜受损程度，是一种反映细胞毒性的指标。肺部毛细血管通透性增加后，会有大量的TP、ALB渗出到肺泡腔，肺泡灌洗液中TP、ALB含量的多少可反映肺泡上皮一毛细血管通透性情况。本实验结果表明，染毒对照组中细胞毒性指标（ACP、AKP、LDH活性和TP、ALB含量）均高于生理盐水对照组，表明PM_2.5染毒可能会增加肺泡细胞膜和肺泡上皮一毛细血管膜通透性，导致细胞内各种蛋白酶等内容物漏出，对肺泡细胞产生毒作用。各剂量干预组肺泡灌洗液内细胞毒性指标水平均呈药物剂量依赖性降低，提示清肺抑火中药对PM_2.5引起的肺组织毒性损伤有一定改善作用。

呼吸道是大气PM_2.5直接作用的靶器官，大气PM_2.5暴露会引起实验动物肺泡灌洗液中的中性粒细胞百分比、单核细胞数升高，引起炎症反应。目前研究表明，与颗粒物引起呼吸道炎症有关的细胞因子包括IL-1、IL-6、TNF-α、IL-8、INF等。TNF-α是前炎癥因子，可促进内皮细胞的黏附作用、白细胞的迁移，以利于细胞向炎症部位迁移而增强其毒性作用。也有研究认为，肺泡灌洗液中TNF-α释放量增加可能是肺纤维化疾病诊断的早期敏感标志。IL-6表达水平的变化是机体早期炎症反应的敏感指标，IL-6主要由单核一巨噬细胞、血管内皮细胞合成，具有多种生物活性，可诱导CRP等急性期反应蛋白的合成，加强其他细胞因子（如INF、IL-1）的效果，参与炎症反应。IL-1β是重要的前炎症因子，可刺激IL-8等多种趋化因子的产生，募集炎症细胞，扩大机体的炎症反应。HS-CRP是一种急性相反应中重要的蛋白，可上调细胞黏附因子和单核细胞趋化因子水平，增强内皮细胞的黏附作用，参与局部或全身炎症反应。当有炎症存在时，HS-CRP水平会急剧升高，是机体炎症反应的一个敏感指标。流行病学研究表明，大气颗粒物污染会导致机体内CRP水平的升高。本实验中，染毒对照组的肺泡灌洗液中炎症因子IL-6、IL-1B、TNF-α、HS-CRP含量和中性粒细胞百分比均高于生理盐水对照组，表明PM_2.5染毒可以升高大鼠机体内细胞因子水平，引发炎症反应，与夏萍萍等研究结果一致。各剂量干预组中，细胞炎症因子水平和中性粒细胞百分比均呈一定程度的药物剂量依赖性降低，表明清肺抑火中药对PM_2.5染毒引起的肺组织炎症反应有一定程度的减轻，也提示清肺抑火中药可能是通过改变炎性因子的释放量来干预PM_2.5导致的肺组织损伤。清肺抑火中药对PM_2.5所致的大鼠急性肺部损伤具有一定的缓解作用，其可能的机制为通过降低PM_2.5对肺部的细胞损伤和炎症损伤发挥作用，这与清肺抑火中药的免疫抑制、抗炎和抗氧化等功效具有密切关系。