高内涵筛选在分子机制研究中的应用

李廷跃 吴帆

暨南大学医学院附属广州红十字会医院/广州红十字会医院普通外科（广州 510220）

高内涵筛选（high content screening，HCS）是一种以细胞为检测对象，通过显微成像法记录多孔板内细胞的图像并通过分析图像中的信息来解析细胞内物质活动的技术工具［1］。该技术系在高通量筛选（high throughput screening，HTS）技术兴起后逐步发展而来，主要依赖于高分辨率的细胞成像系统，充分整合样品制备技术、自动化设备、数据管理系统、检测试剂、生物信息学等资料的优势，在细胞或分子水平上实现对细胞信号发送、信号传导、信号接收及相关一系列反应的成像、分析及筛选［1］。HTS技术结果单一［2］，而HCS技术可在保持细胞结构和功能完整的条件下，同时监测被筛选药品对细胞生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等多个环境的影响，涉及膜受体、胞内成分、细胞器和离子通道等众多靶点，从而能够得到多方面的筛选结果［3］。由此可见，HCS技术可从单一实验中获得大量分子机制相关的信息，从而在近年来的分子机制研究中得到了广泛应用。

1 实现小规模向大规模细胞生物学研究的飞跃

高内涵筛选未出现之前，运用荧光显微技术进行细胞生物学研究仍处于小规模时期。所谓小规模细胞生物学的定义，即指运用显微成像系统从较少数量的实验样品中收集图像数据［4］。通常每份实验样品的细胞总数为10～1 000个。这些系统需要大量的人工操作以满足以下4个条件：（1）维持最理想的光照；（2）试验装置和装载细胞进入小的试验环境；（3）集中扫描；（4）图像采集、显示、加工、分析。由于对手工或从图像半自动数据析取的数据所产生的信息的处理是一个密集型劳动的过程，故想从这些实验中产生新的知识，需要在数周甚至数月的时间里完成许许多多小规模实验。这往往需要耗费大量的人力物力。再者，虽然这样的小规模细胞生物学实验有助于深刻理解细胞分子功能，但这些实验的利用率很低，严重影响实验研究的进展甚至限制实验的继续进行。而这样的研究之所以只能在小规模范围内完成，主要是因为以往的细胞生物学试验尚未能实现自动化（如无法进行自动化分析设计、图像采集、数据存储等等）［5］。

但随着高内涵筛选的出现，它将定量的荧光显微技术施之于自动化的细胞生物学实验，使得大规模细胞生物学研究成为可能。而且，在高内涵筛选的支持下，大规模细胞学实验学已取得不少成就。高内涵筛选是一项研究多个细胞阵列中所包含的丰富的细胞生物学信息的自动化技术。其自动化过程涵盖了实验设计的关键环节、样品制备、图像采集、归档、处理、分析以及细胞信息发掘等多个过程，达到了真正意义上的“高内涵”。“高内涵”即指细胞在结构和功能完整的情况下，其生长分化等过程中的所有信息。

大规模生物学实验同样包括了若干变量的不同，比如细胞种类、基质的化学过程、竞争者或者对抗者的浓度、治疗时间、每个实验细胞参数的种类、时间点的计数和频率等。在这些实验中，通过使用完整细胞制成的高度相关的测量工具可以快速地分析其路径。甚至，在群体里面的每个真实独立的个体的多种细胞活动都可以被检测到［6］。即活的细胞实验所提供的机制学研究需要的细节完全不受影响，效果显著。另外，通过这种大规模细胞生物学试验，还可以快速地了解到，某个特定细胞过程中整个生物体水平的表型变化［7］。

高内涵筛选使大规模细胞生物学成为可能［4］，从而使得机制学的研究变得更加便捷，进而给予分子机制研究必要的条件及助力。如借助高内涵筛选可得到抑制或促进蛋白质表达的某些目的基因，进而达到实现研究分子机制的目标。其目标包括寻找到决定路径的组件、决定给出的路径所在的细胞生理过程的先后顺序、证实治疗方案的分子靶点等等。

2 HCS将分子机制研究带入一个更深的研究层次

蛋白质组学和细胞组学研究依赖于分析生物化学事件中的分子视野。而这些分子视野的获得则需要依赖先进的定量显微技术，如荧光寿命成像显微技术（fluores⁃cence lifetime imaging microscopy，FLIM）和福斯特共振能量转移成像（forster resonance energy transfer imaging，FRE⁃TI）。分子水平检测到的光谱信息，可用于估计细胞形态、分析细胞定位、识别分子或细胞亚群。由此，获取特定环境下细胞对化学和物理刺激反应的分子机制成为可能，即自动化荧光寿命成像显微设置的无人监管操作和成像分析可与这些技术所提供的高内涵相结合，进而对细胞反应的分子机制进行分析。

过去10年的研究已证明，FRETI和FLIM技术对单个细胞中生物化学状态的定量成像起着重要作用。这些成像方法有助于对不同细胞总体进行分析。定量多参数显微技术是一个非常年轻的领域。在该领域中，不断进步的液态样品处理机器人技术和信息技术正逐渐集成到自动化的显微技术中，并通过自动化和无监督操作将高内涵图像信息与高通量容量合二为一。

高内涵应用程序主要用来对影响细胞行为的物质或条件进行定量和多参数分析。举例来讲，对疾病分子机制的理解就需要高分辨率的信息，因为它筛选的目标是细胞和（或）亚细胞水平的。高内涵应用程序旨在监测分子路径：如生物分子的定位、相互作用以及它们对药物或病原体的反应等。无人监管的自动荧光寿命成像技术为可升级筛选平台提供了基础，使高通量水平和高内涵筛选得以合而为一，推动了分子机制研究朝更深层次迈进［8］。

3 HCS涉及广阔的研究领域

3.1 HCS和细胞信号传导 在药物研发进程中，了解环境因素如何触发特定的生物学瀑布式反应是治疗控制的关键。因此，细胞信号转导过程是筛选靶向药物的主要来源。而借助HCS可以更好地理解新发现的蛋白质通过怎样的途径发挥作用［9］，进而为药物研发提供方向和依据。

3.2 HCS和肿瘤学 HCS技术很早就被用于检测细胞凋亡和增殖，从而使其在肿瘤研究中占据了一席之地。实际上，HCS技术对细胞周期，转化和迁移的检测中也具有重要作用。比如，通过改变HCS应用程序中的自动力试验算法并采用相应的试剂盒，HCS便可用于评估肿瘤的转移潜力，甚至观察单个细胞的变化规律，有助于更好的理解抗肿瘤化合物如何与众不同地影响癌细胞［10］以及检测出肿瘤生物标记物的功能。

3.3 HCS和神经生物学 在HCS的早期发展中，人们意识到成像技术在神经元形态定量上具有较大的应用潜能，因此HCS技术最早被运用于监控神经突的增长。如今，HCS在各种各样的神经疾病状态的研究中应用非常广泛。无论是对生物学的基础研究、新模型的构建，抑或是用于干预治疗的小分子的筛选，HCS都有着广泛的应用，其应用实例包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化以及日益增多的脑癌研究等［11］。

3.4 HCS和体外毒性 从某种程度上来讲，不论体外毒性是与周围环境还是与化学因素有关，考虑到HCS技术观察的是细胞对刺激的表型反应，因此所有HCS试验均可被视为“毒性”试验。从相对简单的精确毒性测量，如细胞计数和细胞变圆，到更加特别的细胞健康的测量，HCS可以被应用于多种“毒性”研究中，尤其可在多重端点归一化的多参数试验中帮助定义微妙的毒性状态［12］。

高内涵筛选在分子机制研究中涉及的种种领域以及其过程中所产生的思考和思路，直接或间接使得分子机制研究变得更为多样化和全面化，同时也为分子机制研究提供了多重研究灵感及价值［13］。

4 高内涵筛选在肝癌靶向治疗研究中的作用

4.1 背景 肝癌是严重威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一。根据全球癌症状况最新数据（Globocan 2012）的估计，肝癌已经位居全球恶性肿瘤死亡的第2位，2012年全球肝癌死亡病例约为74.6万例，其中超过50%的肝癌死亡病例发生于我国［14］。尽管近年来肝癌手术切除率已明显提高，肝癌的治疗手段已趋于多样化，但因临床发现的肝癌仍以中晚期肝癌为主，这些患者发现时往往已无手术机会，但又缺乏有效的综合治疗手段，从而限制了肝癌整体治疗水平的进一步提高［15］。近年来，以索拉菲尼为主要代表的分子靶向治疗成为肝癌综合治疗领域中的重要进展［16］。但索拉菲尼往往在短期治疗后即产生耐药，且其耐药机制目前尚不清楚，导致这一问题的原因可能就在于索拉菲尼本身发挥治疗作用的分子机制目前尚不明确，由此可见，进一步筛选潜在的肝癌治疗靶点并阐明其增殖凋亡作用机制，是提高肝癌靶向治疗疗效以及进一步提高肝癌整体治疗水平的关键［17-18］。

4.2 应用 高内涵筛选借助高分辨率的细胞成像系统，充分整合样品制备技术、自动化设备、数据管理系统、检测试剂及生物信息学等方面的优势，在细胞或分子水平上实现对细胞信号发送、信号传导、信号接收及相关一系列反应的成像、分析及筛选，可以在短期内识别大量基因、蛋白的作用。相较于传统的细胞迁徙筛选方法如侵袭小室侵袭和划痕愈合试验，HCS可直接在细胞芯片层面上对细胞行为进行调查研究，从而筛选出一个与肝癌有关的基因库，而且识别出涉及肝癌增殖、转移等生物学行为相关的基因：如LI等［19］近期采用高内涵筛选证实了AEG⁃1和AKRIC2这两个在肝癌远处转移过程发挥重要作用的关键基因，从而为肝癌转移的靶向治疗研究提供了新的候选靶点。笔者最近也将高内涵筛选技术应用于肝癌潜在治疗靶点Mus81基因的分子作用机制研究。笔者前期通过基因芯片得到了数百个与Mus81基因中可能相关的差异表达基因，接着通过生物信息学分析及高内涵筛选，从这数百个差异基因中筛选出数个与肝癌增殖相关的基因，并最终鉴定得到了Mus81的关键下游基因——STC2［20］，从而为针对Mus81基因进行肝癌靶向治疗研究提供了新的理论依据。

4.3 其他 高内涵筛选加快了肿瘤学行为机制研究的速度［21］。它既可鉴定诱导肿瘤细胞生长过程中有丝分裂停止的小分子，也可筛选出候选的肿瘤抑制基因［22］，为了解肿瘤细胞癌变前的生理机制及相关抑制机制提供重要依据。同时，借助多参数的高内涵筛选平板、可视化数据和表型分类方法，可详细地解释个体复合效应和大量收集到的多个参数的细胞反应，从而为肝癌的靶向治疗提供基础。

综上所述，HCS技术在分子机制研究中具有重要作用，其研究对象也已不再局限于小型生物分子，而是逐步扩大到蛋白质、小分子肽类等大分子。如分析Rab蛋白在高尔基前体退化的追踪作用［23］、鉴定肝细胞内控制脂肪小滴形成和生长的小分子核糖核酸等［24］。随着HCS技术的飞速发展及人们对该技术的不断改进提高，如AMSBIO公司分析细胞侵袭的新型3D培养96孔基底膜提取板、Arte⁃mis公司的QS14热电的冷却CCD相机、Greiner Bio⁃One公司的96孔玻璃底微孔板等的开发［25］，因而可以想见，其在分子机制研究中的应用也将愈加丰富多彩。

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