人原代肝癌细胞培养方法现状及展望

王杰钦 游辅宇 彭青 高毅

南方医科大学珠江医院肝胆二科，器官衰竭防治国家重点实验室（广州 510282）

原发性肝癌（primary liver cancer）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在全球所有恶性肿瘤相关死因中高居第二位［1］。原发性肝癌主要包括肝细胞癌（hepatocellular carci⁃noma）、肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma）和肝细胞癌-肝内胆管癌混合型3种不同病理类型，其中肝细胞癌占到85%～90%以上［2］。原代肝癌细胞培养可使肝癌细胞最大程度地保持其在体内的各种生物学特性，有利于对肝癌的发病机制及其防治进行深入的研究。目前国内外尚无相关的综述，本文在此主要针对肝细胞癌，对其原代培养的过程、方法及相关培养条件进行简要介绍，以期为后续的基础及临床研究做好铺垫。

1 取材及预处理

肿瘤组织主要来源于肝癌患者手术切除的标本或细针穿刺活检的标本，并且要求患者未接受过任何抗肿瘤治疗。对于手术切除的肝癌标本，应从瘤体生长活跃、无坏死变性的边缘部位多点取材。取下的标本须立即放入冰浴的培养基中，并尽快送至实验室处理。文献［3］建议热缺血时间不应超过20 min，而冷缺血时间最好控制在1 h以内。另外，在进行分离之前应先将标本上的血块、坏死组织以及结缔组织剪掉，用培养基漂洗数次。细针穿刺活检的标本则可以通过反复离心和重悬静置的方法尽可能除去血细胞［4］。有一点需注意的是，不论是何种标本，取材均应在不影响病理诊断的前提下进行，且事先应征得患者及医院伦理委员会同意。

2 分离方法

2.1 机械法 最常用的为剪碎法。此法直接将组织剪碎成约1 mm3的小块，然后转入T25培养瓶中，加入少量含10%～20%胎牛血清的RPMI⁃1640培养液或DMEM培养液，倒置贴附2～3 h后翻转培养瓶，继续培养至细胞爬出［4-9］。

日本冈山大学MATSUURA［7］通过腹腔镜穿刺活检及组织块培养，从3例肝硬化患者身上成功构建出1株肝癌细胞系，细胞活率在90%以上，且24 h贴壁率为90%，该细胞系在起初的5个月内一直维持其细胞形态而无任何增殖表现。高雄医学大学附设中和纪念医院林子尧等［4］用超声引导下细针穿刺获得的肝癌标本进行组织块培养，结果15例中共成功培养6例，肿瘤细胞培养3代后生长稳定并用于进一步的药敏试验。罗马尼亚TOMULEASA等［6］对1例肝癌手术标本进行组织块培养，2周后团块周边出现散在的单个细胞，到第3周细胞即呈单层贴壁生长，细胞活率＞80%，该细胞随后被成功用于肿瘤干细胞的研究。复旦大学附属中山医院高强等［5］对55份来源于10例乙肝相关肝细胞癌的标本进行组织块培养及多区域测序，发现了广泛的瘤内异质性（intratumor heterogeneity），并由此建立了一套基于基因检测的化疗药物敏感性预测模型，而其获得低传代细胞所需时间大致为1个月［5］。

广东医学院林满洲等［10］采用组织薄片法进行原代肝癌细胞培养，不同之处在于其并非将组织剪碎，而是利用固定在一起的两块手术刀片的间距切取组织薄片。该法在培养成功率、细胞爬出时间及肝癌特异性标记物GPC3的表达上与传统的组织块培养法并无显著差异，但薄片法培养的细胞在形态及洁净程度上较组织块法好。

2.2 酶消化法 包括胶原酶消化法和胰酶消化法。胶原酶又称为胶原蛋白水解酶，能特异性地水解结缔组织中胶原纤维天然存在的三维螺旋结构而对细胞无明显损伤［11］。胰酶（指胰蛋白酶）主要用于分解组织间质蛋白，但对细胞膜也有较强的破坏作用。尽管胶原酶价格昂贵，但由于其作用温和、消化后细胞活率高而被广泛应用于动物及人肝细胞的分离，以下主要介绍胶原酶消化法。

胶原酶消化法首先也是将组织剪成1 mm3左右的小块，然后加入适宜浓度（0.05%～0.10%）的胶原酶（Ⅱ型或Ⅳ型）37℃下消化一定时间（从20 min至1 h不等），再用筛网或纱布过滤，反复低速离心，最后重悬即可［12-15］。

DOUMBA等［12］采用0.1%的Ⅳ型胶原酶对11例早期肝癌合并肝硬化的手术标本进行原代培养，平均产量可达7×106，细胞活率与纯度分别为90%与85%。国内昆山市第一人民医院的陈敏斌等［13］用Ⅰ型胶原酶消化30 min，从8例原发性肝癌标本中成功培养2株细胞系，并对KU⁃0060648的抑瘤机制进行了深入研究。浙江省人民医院王震等［14］将消化时间延长至1 h，结果2例标本均培养成功，第3代至第10代的细胞被用于后续mTOR激酶抑制剂CZ415的研究。第二军医大学的黎江［15］采用0.05%的Ⅰ型胶原酶及优化的新型无血清培养基，对肿瘤组织直接进行消化培养，获得2株肝癌干细胞样的球状细胞系，在连续传代7代后生长趋于稳定，约4 d传一代。同时，他们通过异种移植成功构建了人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，反复传代至第5代后取出进行培养，亦成功培养1株呈上皮状生长的人肝癌细胞系和1株肝癌干细胞样的球状细胞系，后者连续传代8代后生长趋于稳定，约4 d传一代。

3 细胞的纯化

3.1 低速离心法 由于肝细胞密度大于非实质细胞，可以通过反复低速离心（50～100g离心3～5 min，重复3～5次）收集到绝大多数肝细胞。此法常用于动物及人肝细胞的纯化，有研究显示其纯化效果与Percoll密度梯度离心法接近，但耗时更短、成本更低、操作简单。

3.2 密度梯度离心法 其原理主要是利用细胞之间的比重差异对不同细胞进行分层纯化，目前应用较广的分离液有 Percoll和 Ficoll⁃Hypaque。Percoll是一种表面包被聚乙酰吡咯烷酮的硅胶颗粒，由于其扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外它不穿透生物膜，对细胞无毒害作用，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。因为富含活力的肝细胞密度范围为1.08～1.09 g/mL，而受损的肝细胞、非实质细胞及细胞碎片的密度均在1.07 g/mL以下，故可以采用40%～50%的Percoll分离液进行纯化。也有学者推荐采用25%的Percoll分离液［16-17］。Ficoll⁃Hypaque是蔗糖的多聚体，呈中性，也不穿透生物膜。北京大学临床肿瘤学院的张志谦等采用Ficoll⁃Hypaque密度梯度离心法（75%/100%）对原代肝癌细胞与肿瘤浸润淋巴细胞进行分离、培养，并首次证实免疫疗法对复发性肝癌中的干细胞样细胞具有靶向作用［18］。

3.3 胰蛋白酶消化法 适用于成纤维细胞多而旺盛、贴壁较好，而肿瘤细胞量少、贴壁能力较差时［11］。大致流程为向PBS冲洗后的培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，显微镜下观察当大多数肿瘤细胞脱落而成纤维细胞尚未脱落时终止消化，收集上清离心即可得较纯化的肿瘤细胞。事实上，实际操作中经常联合使用几种纯化方法来达到最佳的纯化效果，所以没有必要拘泥于某一种具体的方法。

4 肝癌细胞的鉴定

目前病理诊断常用的肝细胞癌标志物有肝细胞石蜡抗原-1（hepatocyte paraffin antigen 1，Hep Par⁃1）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican⁃3，GPC⁃3）、CD34、多克隆性癌胚抗原（polyclonal carcinoembryonic antigen，pCEA）、CD10、精氨酸酶-1（arginase⁃1，Arg⁃1）、甲胎蛋白（α⁃fetoprotein，AFP）等［19］。

Hep Par⁃1是1993年WENNERBERG等［20］以石蜡包埋的肝组织内线粒体作为抗原克隆出的一种新的单克隆抗体，在肝细胞源性肿瘤中阳性率较高，但无法鉴别肿瘤的良恶性。GPC⁃3由PILIA等［21］于1996年首先描述，属于硫酸类肝素糖蛋白聚糖家族中的一员，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）结合于细胞表面。GPC⁃3在人体胚胎期的胎盘、胚肝、胚肺及胚肾等组织中呈高表达，而成人仅在肺和卵巢等少数组织有低表达，正常肝组织未见表达［22］。GPC⁃3对肝细胞癌的诊断具有很高的特异性，且不受肿瘤分化程度的影响，但其敏感性欠佳［23］。Arg⁃1是一种双核含锰金属酶，在肝脏中高表达，可将精氨酸代谢为鸟氨酸和尿素，进而参与尿素循环，对体内氨解毒起重要作用［24］。Arg⁃1是一种非常敏感的肝细胞癌标志物，但它同样不能区别肝细胞源性肿瘤的性质。AFP为肝癌细胞返祖性合成的一种高分子质量胚胎蛋白，目前仍是临床上最常用的诊断原发性肝癌的血清标志物［2］，其特异性很强但敏感性较低。

以上几种肝细胞癌标志物的比较如下：敏感性：Arg⁃1＞GPC⁃3＞Hep Par⁃1＞AFP；特异性：AFP＞GPC⁃3＞Hep Par⁃1＞Arg⁃1；阳性预测值：AFP＞GPC⁃3＞Arg⁃1＞Hep Par⁃1；阴性预测值：GPC⁃3＞Arg⁃1＞AFP＞Hep Par⁃1［24］。可见，联合检测Arg⁃1和GPC⁃3对肝癌细胞的鉴定具有极高的敏感性和特异性，有助于提高结果的准确性。

5 培养基的选择

现有的报道基本上都采用DMEM、RPMI⁃1640和Williams′E 3种培养基。DMEM和RPMI⁃1640广泛用于各种原代细胞的培养，而Williams′E是肝细胞专用培养基。其他如无血清培养基HepatoZYME⁃SFM也常用于原代肝细胞的培养，但鲜有用于原代肝癌细胞的培养。有研究显示Williams′E相较于其他几种培养基更适合于原代肝细胞的短期培养［25-26］。实际上，人们往往会根据研究的需要在这些培养基中添加不同的组分，例如胎牛血清（fetal bovine serum）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、胰岛素（insu⁃lin）、地塞米松（dexamethasone）、胰高血糖素（glucagon）、谷氨酰胺（l⁃glutamine）等。

血清的主要作用在于提供细胞生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其他营养物质，维持细胞较好的生长状态，促进细胞的生长与分裂增殖［27］。然而，也有研究［26］表明在血清的长期作用下肝细胞会逐渐失去其原有的表型，有趣的是，恰恰也是利用这一点，无血清培养基被广泛用于肝脏干细胞的研究［28］。HGF被认为在肝再生过程中起到最重要的作用，其他细胞因子起到不同程度的辅助作用［29］。当细胞进入G1期后，HGF和EGF等细胞因子通过促进细胞有丝分裂，使细胞进入S期，促进增殖［30］。胰岛素可通过作用于肝细胞表面的胰岛素受体，增强肝细胞对葡萄糖的摄入和利用，同时促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，从而增强肝细胞的活力与功能［31］。地塞米松、胰高血糖素为体内重要的激素，参与细胞的糖代谢、脂类代谢等，调节细胞的增殖与功能表达［32］。谷氨酰胺是人体内含量最丰富的游离氨基酸，也是一种条件必需氨基酸［33］。作为DNA合成的前体，保持充足的谷氨酰胺有利于DNA合成，促进细胞分裂再生。其次谷氨酰胺通过生成谷胱甘肽这一机体保护酶和其他蛋白质巯基对抗自由基损害的抗氧化剂，减轻氧自由基造成的肝细胞损伤，促进肝组织再生［34］。

6 培养模型

迄今原代肝癌细胞的培养仍主要采用传统的二维贴壁培养模型，这一点和三维培养模型在正常原代肝细胞的研究中正如火如荼形成鲜明的对比［17，35-38］。相比于二维培养模型，三维培养模型现已成为公认的能较好模拟体内肿瘤细胞微环境及细胞间相互作用的体外模型。目前三维培养模型主要包括三明治培养模型、聚球培养模型、去细胞支架培养模型、生物反应器培养模型、微流控培养模型等。其中，动态培养模型因具有类似体内的流体梯度及较好的可控性，是未来的研究热点。本课题组在前期的研究中采用三维培养模型培养原代肝癌细胞，细胞在形态及功能上均优于二维培养模型（相关结果尚未发表），这也验证了上述观点。

7 总结

目前肝癌细胞的原代培养主要用于细胞建系/株和体外药敏试验，但受限于种种客观因素仍无法做到大范围的推广。主要存在的问题有：（1）人肝癌细胞的原代培养难度远大于动物及人正常的肝细胞，标本来源受限，培养成功率低；（2）由于标本的临床及病理特征参差不齐，加上广泛存在的瘤内异质性，实验数据的可比性及可信度均大打折扣；（3）如何保持原代肝癌细胞生物学特性的稳定，这也是原代培养技术共同面临的一大难题；（4）如何避免成纤维细胞等杂细胞的污染，使研究结果能更真实地反映肝癌细胞的特性。

总之，原代肝癌细胞的培养方法尽管存在诸多不足，但其在肝癌细胞的体外研究中仍旧具有不可替代的重要作用。未来除了进一步改善其分离、纯化方法以及对培养基进行优化，还可以尝试使用三维动态培养模型以达到更接近体内环境的目的。我们相信，肝癌细胞原代培养技术的不断完善必将推动肝癌的基础及临床研究，进而为更多的肝癌患者带来新的福音。

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