双磷酸盐及其功能化药物在骨转移诊断和治疗中的研究进展

林勤剑

广东三九脑科医院临床药学科（广州510510）

骨转移癌是一类广泛研究的继发性癌症，转移灶的存在大大降低了治愈的可能性并严重影响了癌症患者的生活质量。骨组织特殊的微环境可支持肿瘤的存活和生长，有助于骨转移的形成［1-2］，目前报道的转移到骨的最常见原发性肿瘤包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、口腔癌及多发性骨髓瘤［3-4］，近75%的晚期乳腺癌或前列腺癌患者易发生骨转移，降低了患者的生存率［5］。骨中肿瘤的发展是由肿瘤细胞和骨细胞（成骨细胞和破骨细胞）之间相互刺激、相互作用的结果。骨转移也涉及其他类型的细胞如成纤维细胞和免疫细胞（巨噬细胞、自然杀伤细胞、T和B细胞），不同细胞复杂的相互作用会破坏由破骨细胞和成骨细胞介导的骨平衡［6］，最终引起溶骨反应或成骨细胞损伤导致骨形成减少。

骨转移的形成机制与其他非骨骼器官的肿瘤转移机制相似，即原发灶肿瘤细胞在蛋白水解酶辅助下逃避宿主监测到达骨组织微环境，具有迁移能力的癌细胞同时侵入骨髓基质，并在内皮骨表面诱导自己的血液供应。随后，癌细胞可根据肿瘤的性质刺激破骨细胞或成骨细胞的活性。在转移性骨病变中，骨表面通常被破骨细胞和肿瘤细胞包围，破骨细胞在肿瘤细胞存在时，由甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）和核因子κB配体的受体激活剂（RANKL）等激活而诱导骨吸收，刺激骨质溶解，并释放促进肿瘤进展的TGF⁃β等生长因子，建立了促进肿瘤生长并加速骨骼破坏的恶性循环［7］。基于骨转移的分子机制，目前破骨细胞抑制剂被提倡作为预防骨转移的有力工具［8］。在骨转移发展的新型疗法中，基于双磷酸盐的治疗颇具吸引力，这不仅得益于其作为抗骨吸收药物长期临床应用的优势，也与在抗肿瘤组合疗法中所呈现的优势密切相关。

1 双磷酸盐的一般特征及作用机制

双磷酸盐是具有与中心碳原子结合的两个磷酸酯基团（P⁃C⁃P）的无机焦磷酸盐类似物，与焦磷酸盐中水解不稳定的P⁃O⁃P键相反，该P⁃C⁃P键对酶水解具有抗性。研究证实，双磷酸盐对羟基磷灰石的亲和力高于其他钙基矿物质，如草酸盐、碳酸盐或焦磷酸盐等，因此可通过与骨组织细胞外基质中的矿物相（即羟基磷灰石）结合来抑制骨吸收，这种现象在骨转换率较高时更为显著。矿物相的高选择性和体内相对低毒促进了双磷酸盐的临床应用，一般来说，双磷酸盐根据其化学结构可分为无氮（非氨基-双磷酸盐）及含氮（氨基-双磷酸盐）两类。目前临床批准的非氨基二膦酸盐主要包括氯膦酸盐、替鲁膦酸盐和依替膦酸盐，而氨基双磷酸盐包括伊班膦酸盐、帕米膦酸盐、阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐。基于对骨组织的强亲和力，双磷酸盐是目前治疗佩吉特病、骨质疏松症、发育不良和成骨不全等慢性骨病的一线药物［9⁃10］。不仅如此，临床前研究和临床试验都证实，双磷酸盐可避免癌症引起的骨质流失并防止癌症患者骨转移的发生［11］。

不同分子结构的双磷酸盐具有不同的作用机制和药效，但都可通过破骨细胞介导的内吞而作用于成熟的破骨细胞，进而抑制骨吸收；或通过干扰肿瘤细胞和骨细胞之间的恶性循环来诱导骨转移微环境中的破骨细胞凋亡，减轻骨转移和骨破坏的程度。

近年来，双磷酸盐应用于骨转移预防的辅助治疗临床效果得到了广泛的认可［12］。其机制在于抑制破骨吸收间接抑制肿瘤生长或直接发挥抗肿瘤效应。此外，双磷酸盐可激活γδT细胞以引发宿主免疫应答，分泌促炎细胞因子并发挥对肿瘤的毒性作用［13］。双磷酸盐也可有效减少肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞（TAM），最终影响异种移植小鼠模型中的肿瘤生长［14］，或逆转肿瘤环境中TAM的亚型，即由M2型逆转为杀死肿瘤细胞的M1型。

2 双磷酸盐功能化药物及载体的研究和应用现状

双磷酸盐目前仍被主要用作抗骨质疏松药物，然而，长期、高剂量、广泛的双磷酸盐给药引发的不良反应仍不容忽视，如下颌骨坏死、非典型股骨骨折、胃肠道副作用及肾功能损害等。双磷酸盐对矿物质的高度亲和性为其与显像剂、抗肿瘤药物及纳米载体或其他生物医用材料偶联并靶向骨组织提供了可能。在过去的几十年，双磷酸盐功能化的诊断和治疗策略不断发展，保证了其体内应用稳定性的同时，仍保持双磷酸盐的功能化。

2.1 双磷酸盐功能化显像剂 荧光素可用于在体外内标记肿瘤细胞或肿瘤组织，而用于肿瘤的临床前期研究［15］。荧光素可通过氨基与双磷酸盐偶联，如利塞膦酸盐的吡啶基与荧光素通过形成环氧化物而稳定偶联。双磷酸盐功能化显像剂的临床前研究已有大量报道，BHUSHAN等报道了通过酰胺键将近红外（NIR）荧光体与帕米膦酸盐偶联，与其他钙盐相比，其与羟基磷灰石的亲和性提高8倍，可为骨转移钙化灶的早期检测提供可能。远红外荧光体通过酰胺键与帕米膦酸盐偶联后，可实现双磷酸盐体内代谢、与细胞相互作用及特异性累积的实时检测。该类双磷酸盐功能化的荧光分子探针均可通过光学成像定量评估骨肿瘤模型中肿瘤体积的变化、骨肿瘤的矿化及骨转移程度等［16］，且在临床前的猪、Balb/c小鼠、裸鼠和NCR小鼠等动物模型中均有研究［17-18］。

另一类显像剂，放射性示踪物也可通过螯合作用与双磷酸盐偶联，包括 Tc⁃99m、Sr⁃89、Re⁃186/188、Ga⁃67/68、In⁃111、Lu⁃177、Ho⁃166和Ra⁃223 等，偶联后的探针可作为骨靶向的示踪剂，采用PET⁃CT等手段用于骨转移等骨病的诊断和治疗［19］。也有文献证明，基于对羟基磷灰石的亲和性，双磷酸盐可通过与金纳米颗粒偶联，实现对钙化灶X射线检查的敏感性，并可提高X射线的衰减系数［20］。

2.2 双磷酸盐功能化的抗肿瘤药物 双磷酸盐可通过酯键或氨基甲酸酯键与目前常规应用的抗肿瘤药物偶联，如甲氨蝶呤，苯乙酸和核苷类似物［2′-脱氧-5-氟尿嘧啶（5⁃FdU），1⁃β⁃D⁃阿糖呋喃脲嘧啶和叠氮胸苷］等，形成在生理条件下可稳定到达骨转移部位的复合物。临床前研究结果显示，基于双磷酸盐的骨靶向性，双磷酸盐与甲氨蝶呤偶联后，其对骨肉瘤的抑制效率比单独使用甲氨蝶呤提高了5倍。双磷酸盐功能化的抗肿瘤药物另一个重要的优点即化疗药物全身毒性的降低，如5⁃FdU与氨羟二磷酸二钠或阿伦磷酸钠偶联后，可用于骨转移癌的治疗，且全身细胞毒性显著降低［21］。除传统的化疗药物外，最近的研究表明，双磷酸盐也可靶向携带抗肿瘤小分子抑制剂BET bromodomain，如JQ1至骨肿瘤发生部位，而发挥靶向杀灭肿瘤细胞的效果［22］。

2.3 双磷酸盐功能化的纳米载体 药物与纳米载体的共价偶联可借助纳米材料体内循环时间长、实体瘤的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention，EPR）、不可穿过血脑屏障以避免抗神经毒性等优点以增加的肿瘤定位，促进体内治疗效果的增强。双磷酸盐功能化纳米颗粒的临床前研究在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等骨转移癌和骨肉瘤、多发骨髓瘤等骨肿瘤中有较多研究，动物模型多为Balb/c裸鼠、SCID鼠和Swiss鼠［23-25］。如将阿伦磷酸钠与载药PLGA纳米颗粒偶联，评估其治疗裸鼠骨转移癌的效果可见，阿伦磷酸钠发挥的骨靶向作用，可大幅提高偶联物的治疗效果［26］。THAMAKE等开发了表面包被阿仑膦酸盐的PLGA药物递送纳米颗粒系统，内部包封姜黄素（化学治疗剂，抑制RANKL诱导的骨吸收）和硼替佐米（蛋白酶体抑制剂）后，在骨转移模型中表现出阻止骨吸收并降低肿瘤生长速率的优势［27］。SWAMI等［28］也合成了包被阿仑膦酸盐的PLGA载药（硼替佐米）纳米粒子，进一步于表面PEG化，以增加载药纳米颗粒在体内的循环时间，对多发骨髓瘤等的治疗效果显著。与此同时，肿瘤微环境的特点为双磷酸盐功能化纳米载体的发展提供了可能，在药物与纳米颗粒之间引入酶解接头，可被肿瘤周围高表达的蛋白水解酶水解，增加药物主动靶向的效果。如有研究将阿仑膦酸钠和紫杉醇均通过四肽 Gly⁃Phe⁃Leu⁃Gly（GFLG⁃ONp）与N⁃（2⁃羟丙基）甲基丙烯酰胺（HPMA）共聚物偶联，肿瘤细胞中过表达的溶酶体酶cathepsin B可特异性识别GFLG接头，实现药物的靶向递送，结果表明联合治疗对肿瘤的骨转移癌抑制率较单独使用阿仑膦酸盐或紫杉醇提高了60%。

除了传统的纳米载体外，双磷酸盐也可与脂质体偶联，目前只有两种类型的双磷酸盐功能化药物（99mTc⁃羟基亚甲基二膦酸盐和99mTc⁃亚甲基二膦酸盐）已被批准用于恶性骨肿瘤的临床检测和治疗。唑来膦酸功能化的脂质体也有大量的临床前研究，如包封脂质体形成LipoZol，相对于单独使用的唑来膦酸，Lipzol对前列腺癌（PC3）和多发性骨髓瘤（OPM2）的抑制率提高了42%～46%，且可抑制肿瘤血管生成，降低肿瘤血管密度［29，32］。

双磷酸盐还可通过与其他类型的纳米颗粒，如磷酸钙纳米颗粒自组装形成PLCaPZ复合物，表面辅以PEG修饰，抑瘤率高于68%。

2.4 双磷酸盐功能化的生物材料 双磷酸盐功能化的生物材料应用于骨转移治疗近年来也多有报道，除传统的钙磷基材料外，双磷酸盐也可与其他类型的生物材料偶联，如与水凝胶类材料偶联，并负载生长因子，形成类细胞外基质成分，抑制骨转移病灶部位的骨吸收作用［33］；与透明质酸偶联，通过特异性作用于破骨细胞表面的CD44受体而发挥溶骨抑制效应［34］；或与高分子聚合物偶联，形成生物安全且可降解的可注射支架材料［35］；也可与生物玻璃类材料偶联，应用于骨肿瘤或骨转移癌治疗后的骨组织工程中［36］。

3 结论与展望

基于双磷酸盐对骨转移区域中高代谢区或病理性钙化区的选择性亲和力，可作为一类理想的骨靶向剂。本文前述了双磷酸盐及其功能化药物、载体在骨肿瘤和骨转移癌的诊断和靶向治疗中的研究进展。包括双磷酸盐可与荧光探针或放射性示踪剂结合成像，如双磷酸盐与荧光显影剂、放射性核素如γ射线（用于SPECT成像）、正电子发射体（用于PET成像）和磁共振造影剂等结合用于骨靶向成像等，以检测与骨转移以及骨骼外肿瘤相关的微钙化灶；或与抗肿瘤药物、纳米载体或生物材料偶联靶向治疗骨肿瘤，如与一系列抗肿瘤化合物、小分子抑制剂或纳米载体（脂质体或聚合物纳米颗粒）偶联，通过靶向递送药物或纳米载体的EPR效应，增加肿瘤部位药物浓度，提高药物的治疗效果，并降低全身毒性，因此具有应用于骨肿瘤或骨转移癌骨组织工程中的潜力。

目前，双磷酸盐已在临床应用于骨质疏松等骨病的治疗，延缓骨骼病变的发生和进展。然而，双磷酸盐的广泛或全身应用的副作用仍较多，为推进双磷酸盐应用于骨转移癌的治疗或双磷酸盐功能化药物/载体的临床应用，临床前研究应采用更接近临床的肿瘤模型，如患者来源的异种移植（PDX）模型，或人源细胞系建立原位骨肿瘤模型和骨转移模型等。从医用材料发展的角度，骨靶向的双磷酸盐功能化纳米载体的体内分布模式也需进行更深入的研究，纳米载体的大小、电荷、分子量、偶联方式和体内作用机制等应详细说明，以实现最高剂量的药物递送和最佳的治疗效果，推进双磷酸盐联合用药的临床推广应用。

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