木本植物离体培养成熟效应研究进展

邵妍丽，任军辉，德 央

(1.西藏职业技术学院；2.西藏自治区罗布林卡管理处，拉萨 850000)

木本植物在生态、经济、社会等领域中发挥着重要的作用，随着对木本植物需求量的迅速增加，离体培养作为一种重要的快速繁殖技术在木本植物的繁殖过程中得到了越来越广泛的应用[1]，但在离体培养过程中成熟效应会对植物体造成很多不良影响，如植物体内细胞、组织、器官等幼态特征部分或完全消失[2-4]，植物体迅速的衰老死亡等，严重影响了木本植物离体培养的繁殖效率[5]；但通过一些特定的形态学、生理生化标记及分子生物学等研究方法的应用可以找到木本植物成熟效应发生的原因，加之目前通过在离体培养过程中的条件控制，为下一步克服成熟效应找到更为有效的方法。

1 离体培养过程中各类研究方法的应用

1.1 形态学研究

为了使成熟材料的复幼有一个统一明确的质量及数量标准，通过形态学标记是一个最直观方法。在最近几十年，很多学者就通过芽的萌发率、增殖率、生根率来比较成龄树和幼龄树的离体培养时的生理成熟程度，结果表明萌发率、增殖率、生根率各项指标均较低的成龄树的生理成熟程度较高，后期在器官分化的过程中分化能力较差[6]。

黄发新等[7]选取10株20 a生杉木上部枝条与树干基部新萌生枝条进行离体培养，分别以芽分化数量、嫩梢数量、嫩梢长度、生根率、根长等作为形态标记，结果发现成年树树干基部新萌生枝条在经过离体培养后对杉木有明显的复壮作用。董胜君等[8]对山杏的离体培养研究中发现，随着取材母树树龄从10 a、4 a、1 a的不断降低，其组培苗的株高、叶长、叶宽、根系数量及根系长度的指标值依次升高。张世红等[9]在毛白杨离体培养成熟效应的研究结果中表明，成年毛白杨由上部、中部、下部、直到基部的顶芽，随着幼化程度的不断加深，其在分化系数和生长量两项指标的数值呈上升趋势。Lyrene[10]选择了以芽直径及叶形态作为栎属植物的形态标记。Arnauld等[11]将成龄再生植株芽的正向或斜向生长作为一种形态学标记。Hess[12]将生根能力作为一些木本植物幼龄材料的形态标记。Mcgowrna等[13]通过欧洲栓皮栎和红栎的成龄及幼龄材料的离体培养，确定出一系列的形态学标记，包括增殖茎芽与水平面角度、每个茎芽增殖的绿叶数、叶面积、增殖茎芽总数、每个外植体增殖茎芽数、增殖茎芽上部直径、增殖茎芽中部直径、增殖茎芽下部直径等，并通过建立一个统一的数学模型为栎属植物的形态学标记提供量化依据。

1.2 生理及生化研究

同工酶是一种十分有效的生理生化标记，可以将酯酶和过氧化物酶(POD)等标记离体培养时材料的成熟度[14]。在成熟材料的组织培养复幼过程中，与成熟度相关的酯酶和过氧化物酶并不能被检测到，但是在新萌出的茎芽中这些酶被证实具有活性，相比之下，在栎属植物诱导生根的早期，过氧化物酶是不能作为生化标记的；确切的说，成龄和幼龄材料不同的生根能力证明生根过程与总的过氧化物酶活有关而与特定的过氧化物酶的活性的变化无关[15]。Fernandez等[16,17]对欧洲栓皮栎不同成熟度繁殖材料的离体培养时发现，多酚类物质也可以作为栎属植物茎段离体培养时繁殖材料成熟程度的生化标记。成龄和幼龄材料生根过程中多酚类物质含量的不同是由于外植体内单宁、黄酮醇等物质含量的差异造成的，这同时也表明两种材料在生根能力方面有差异。谭建晖等[18]通过测定桉树离体培养后的叶绿素、可溶性蛋白、MDA(丙二醛)、PRO(游离脯氨酸)的各物质含量及POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)、SOD(超氧化物歧化酶)活性，指出离体培养1代的抗衰能力最强，而8代、15代、28代的抗衰退能力相对较弱。

可溶性糖的含量变化可以在一些树木的体细胞胚胎发生的成熟过程中被检测出来，在云杉体细胞胚成熟的过程中，LiparskaH等指出，在体胚成熟过程中的可溶性糖在体细胞胚成熟的过程中,体胚细胞内部的可溶性含量整体上呈现缓慢减少的趋势,其中蔗糖和其他糖类的比例发生明显改变,特别是发育到后期时,葡萄糖含量几乎已经不存在,蔗糖和果糖虽然能被检测到,但是果糖含量较低[19]。李冬梅[20]在对龙眼的体细胞胚胎发生的研究中发现，在高浓度蔗糖及黑暗条件下，随着体胚的成熟葡萄糖和果糖的含量先增加后减少再增加，呈“双峰”变化趋势。但可溶性糖类是否可以作为体胚发生过程中一种成熟效应的生理生化标记还未见报道。

采用生理、生化标记可以在离体培养时的形态变化前，在细胞水平上反应外植体的变化，从而确定外植体的成熟状态。Istv＇an Kir＇aly1等[21]对欧洲白栎离体培养生根过程光合作用的研究中指出，不同成熟度的外植体在生根时添加激素方式的不同，植株CO2的固定效率是不同的。Vidal等[22]研究欧洲白栎不同成熟度的繁殖材料生根时，通过添加不同激素促生根，在细胞学水平观察发现，幼龄材料会在生根时细胞发生分生化，而成龄材料并未发生此类现象。

1.3 基因表达及调控研究

大量研究表明，植物体的生理衰老是一个高度程序化的过程[23]。李坤霞[24]对毛白杨成熟材料的组织培养复幼，通过在转录水平上对mRNA差异显示的重复对比试验，并结合分子杂交，对树冠部453bp的cDNA片段的鉴定发现，成熟效应可能与其有关。同时序列分析结果表明，该片段与茶树的NADHI和NADHV有较低的同源性，仅有32个碱基同源，它可能是一个新基因，但其编码的氨基酸的序列及其功能尚不清楚。目前其他木本植物离体培养的成熟效应与基因表达调控的关系还未见报道。

2 木本植物离体培养过程中减少成熟效应发生的方法

2.1 采用幼龄材料进行离体培养

植物的营养繁殖能力与幼态因素相关。一般材料愈年幼营养繁殖就愈容易，幼态组织比老态组织具有较高的形态发生能力。由于成龄材料的扩繁很难成功，许多树种最先通过胚或幼龄材料为外植体。冯金玲等[25]学者在对木本植物锥栗进行研究时,选取胚、叶片、腋芽、韧皮部、茎段作为外植体,结果发现胚与其他外植体相比最容易消毒,其不定芽诱导率也是最高的,诱导效果最佳, 这是由于幼年态的它们容易分化及再分化。叶片的取材部位对木本植物组织培养的成败与否影响也很大,但通常来说都是越幼嫩的叶片越容易分化,越靠近叶片中脉处的组织越易形成愈伤沮织。赵政阳等[26]在对苹果(Maluspumila)叶片离体培养的研究中发现,当年抽枝的新梢顶端处刚展开的幼叶最易分化,其再生能力最强,同时叶片的中部靠近叶脉出的部分叶片比顶部或基部更易于再生.

在芽和茎段的培养中，最早都是以幼龄材料为外植体进行植物器官培养的研究。直到1987 年，法国科学家 J.M.Favre 和 B.Juncker[27]以 1～7月生的欧洲白栎实生幼苗和成年树(150 a生)萌条扦插的茎段作为外植体，研究得出未木质化的嫩枝对芽的萌发效果最好。这是以成龄材料为最初外植体进行器官培养探索的开端，在此之后，Manzanera和 Pardos[28]相继进行了成龄树离体培养的研究。他们的研究结果表明：来自成龄树的材料与幼龄材料相比较，芽的萌发率、增殖率、生根率均较差。成龄树的生理成熟度较高，即便是成龄树的嫩枝也比一年生的实生苗的半木质化枝的器官分化能力弱。同时，他们在实验中通过对成龄材料的反幼处理，如修剪、诱导根萌条、室内培养等一系列前期管理措施，以及对插条喷施 BA 获得幼化材料等方法来降低栎属植物的生理成熟度，能够有效地提高成龄材料的增殖率和生根率。李芳东等[29]通过对白花泡桐优树组织培养幼化过程中发现，优树嫁接新萌发的嫩芽、优树成熟枝条水培嫩芽和优树成熟枝条休眠芽在萌发率和生长状况方面，作为幼龄材料的优树嫁接新萌发嫩芽组培幼化的效果最好。

2.2 不同培养基配方对繁殖材料的影响

基本培养基种类不同会对不同植物体的离体培养复幼产生影响。黄健秋等[30-31]对云南松成熟胚的体胚发生的研究中指出，改良的P6培养基对成熟合子胚的发生有很强的促进作用，DCR培养基及MS培养基并不适合，但DCR培养基可以作为马尾松成熟胚的发生的最适培养基。刘淑兰等[32]选择核桃(Juglansregia)的叶片、叶柄切段、节间、叶脉、茎尖、胚、子叶为外植体进行离体培养，基本培养基采用MS、WPM、K、B6、White，虽然所有种类的外植体都能产生愈伤组织，但经过筛选，仅在MS和WPM上茎尖和胚能分化出多芽。

培养基中不同营养成分对成熟效应也有一定的控制作用。阙国宁等[33]在杉木的组培复壮过程分析中发现，在MS基本培养基中添加BA和IBA，从1年生母树上采集的茎段经离体培养后，产生的嫩梢数量均高于从5年生、10年生的母树上采集的茎段。 Franclet 等[34]在对花旗松离体培养的复壮过程研究中发现，细胞分裂素类物质(主要是BA)对外植体的刺激能够促进其组织幼化，但培养时间过长会出现玻璃化或枯死的现象。Manzanera等[28]同时通过对欧洲栓皮栎不同基因型的幼龄(3个月实生苗茎段)及成龄材料(30、110 a生成龄母株茎段)的增殖培养方式，包括培养基种类、激素配比、培养时间等，生根培养的最佳激素组合及浓度配比等的研究指出，成龄材料可以通过离体培养添加BA来达到复幼的目的；Favre J M等[27]在欧洲白栎的离体培养研究中，选择一年生实生苗及150 a生成龄母株的成熟材料进行离体培养，在含有木炭的培养基中，幼龄材料出现了阶段性的生长，生根正常，但产生叶数却明显减少，而成龄材料则全部死亡；采用含有较低浓度的BA培养基后，幼龄材料的阶段性生长消失，但未生根，成龄材料则生长良好；同时Favre J M等在成龄及幼龄的离体培养研究也发现，低盐浓度的培养基，如SH，有利于离体培养的进行，BA对增殖培养的进行是必须的，添加低浓度的NAA可以提高增殖效率，特别是对成龄材料，激素的种类是生根的最重要因素，添加低浓度的IBA对生根效果最好，同时较高浓度的蔗糖有助于生根。

2.3 利用合适培养方式降低成熟效应

培养方式的不同会对成熟效应的发生以及持续的时间产生一定的影响。Bonga J M等[35]将取自500 a生北美红杉的外植体在高浓度BAP的培养基上经反复继代培养复壮后可以诱导出组培苗，张世红等[9]通过对毛白杨的组培苗进行多次继代，也发现随着继代次数的增加，组培苗生长不断加快，株高有所增加，成熟组织被进一步幼化。Vieitez等[36]研究欧洲白栎成龄繁殖材料的离体培养时指出，当繁殖材料垂直放置在培养基中进行增殖培养时，随着增殖次数的增加增殖能力会下降，但是水平放置的繁殖材料增殖能力会得到加强，并且增殖周期也会相应缩短，同时指出，生根能力与外植体本身的基因型有关，但是在生根培养前的5 d进行暗培养，可以有效提高生根能力。

在尽可能采用外植体小型化的同时尽量减少伤害胁迫(外植体增大受损伤程度会导致幼态程度下降)，有利于其器官发生。Franclet[34]在研究花旗松、北美红杉和胡桃等离体培养时外植体小型化过程中发现，小型化的处理能够促进外植体的复壮。Monteuuies[37]在诱导100 a生巨杉离体培养复幼中也发现，树体萌芽前后取材足够小是至关重要的环节。

3 展望

目前对于木本植物离体培养的成熟效应的控制仅仅是通过一些培养条件的控制，并未从成熟效应的发生机理上给予有效的控制，在今后的研究中，可以根据与衰老相关的各种氧化酶、各类生理活性物质的变化研究减少成熟效应途径，特别是对于成熟效应的基因表达方面，可以通过特定基因的表达调控克服成熟效应的发生。