南五味子多糖急性毒性及对小鼠肝损伤保护作用机理探讨＊

颜志婷，肖冬梅，陈杰

南五味子系藤本植物，包括多糖、木脂素、挥发油等活性成分，具有补肾宁心、益气生津等功效，现代药理学认为，五味子的活性成分能够抗癌、抗氧化、保肝等，其中北五味子多糖对于小鼠肝脏有显著的保护作用，能够使小鼠肝脏因四氯化碳造成的肝损伤减轻，并能较好地保护大鼠因CC14所致的肝损伤[1，2]。不过临床上关于南五味子的毒性及保肝作用，相关研究较少，因此研究分析南五味子多糖的急性毒性反应及对急性小鼠肝损伤的保护作用以为临床对南五味子的应用提供有利依据具有重要意义[3，4]。本研究探讨分析南五味子多糖急性毒性及对小鼠肝损伤保护作用机理，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 仪器选择 ⑴德国徕卡仪器有限公司生产的RM2235型石蜡切片机、SI5020型自动染色机、DM4000B型生物显微镜；⑵安徽中科中佳科学仪器有限公司生产的HC-2062型高速离心机；⑶广东美的微波电器有限公司生产的EG823MF4-NA型微波炉；⑷德国欧宝有限公司生产的XL600型全自动生化分析仪；⑸上海精密仪器科学有限公司生产的7225B型紫外可见分光光度计；⑹北京丹佛仪器有限公司生产的S-114型电子分析天平；⑺广州旭朗机械设备有限公司生产的HK-02A型手提式粉碎机。

1.2 试药 ⑴自制的南五味子多糖提取物；⑵广州科方生物技术有限公司提供的ALT和AST试剂盒；⑶天津市大茂化学仪器供应站提供的四氯化碳；⑷万邦德制药集团股份有限公司生产的联苯双脂滴丸；⑸其他试剂均为国产分析纯，水为蒸馏水。1.3实验动物 本次研究实验动物包括SPF级昆明种小鼠80只，购自南昌大学医学部实验动物中心。

1.4 方法

1.4.1 南五味子多糖提取 将100g干燥的南五味子粉末放入30倍量水中，置入微波炉，设定温度80℃，进行30min的提取，然后将之进行过滤，浓缩滤液到200ml，放入3倍量95%乙醇醇沉过夜，采用Sevage法将蛋白去除，经葡聚糖凝胶柱层析纯化处理，最终获得南五味子多糖。

1.4.2 南五味子多糖含量测定 取100mg葡萄糖，葡萄糖在105℃下干燥至恒重，将之放入蒸馏水中进行溶解，并在100ml量瓶之中定容，配制成为1.0mg/ml的葡萄糖对照品贮备液。对该贮备液分别精 密 吸 取 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml 放 入25ml的量瓶中，定容至刻度。取干燥具塞试管将之分别移取1ml于其中，取5%苯酚、98%浓硫酸分别加入每支试管，苯酚加入1.0ml，浓硫酸加入5.0ml，将其摇匀之后放置于30℃的水浴中进行30min的反应，完成后冷却至室温，测吸光度于波长490nm处，以吸光度作为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。精密称取25mg南五味子多糖放入水中溶解，并将之于100ml量瓶中定容。取干燥具塞试管将多糖溶液移取1ml于其中，取5%苯酚、98%浓硫酸加入试管，苯酚加入1.0ml，浓硫酸加入5.0ml，将其摇匀之后放置于30℃的水浴中放置30min，完成后冷却至室温，测吸光度于波长490nm处，最后带入标准曲线对多糖含量进行计算。

1.4.3 急性毒性试验 精密称取20g南五味子粗多糖溶解于适量蒸馏水中，并将之定容至100ml的量瓶中备用。取10只雌性小鼠和10只雄性小鼠，在12h的禁食处理之后将之随机分为空白对照组10只和南五味子多糖组10只，空白对照组给予等容积蒸馏水，南五味子多糖组在24h内以最大体积40ml/kg灌胃给药3次，进行14d的持续观察。观察记录小鼠体质量等变化，若小鼠死亡立即进行解剖观察，包括心肝脾肺肾等脏器变化，若病理异常实施组织切片检测。

1.4.4 急性肝损伤保护作用试验 采用0.5%CC14致小鼠急性损伤模型，取60只小鼠随机分为南五味子低剂量（347mg/kg）、中剂量（694mg/kg）、高剂量（1388mg/kg）组，CC14模型对照组，空白对照组，联苯双酯组 （22.5mg/kg）。南五味子不同剂量的3各组和联苯双酯组均以40ml/（kg·d）的量灌胃1次，而空白对照组和模型对照组则给予等容积蒸馏水，进行6d的连续给药。除空白对照组外的其他组均对小鼠注射0.5%CC14菜籽油溶液，每只注射0.2ml，造模之后进行16h的禁食，不禁水。对小鼠实施麻醉后于眼眶取血，447×g离心20min，将血清分离后采用ALT、AST试剂盒进行检测。在对小鼠取完血之后立即实施解剖操作，取心肝脾肺肾等脏器并将脏器表面血液吸干后称重，对脏器指数进行计算。

1.4.5 病理切片观察 取小鼠肝右叶使用10%的福尔马林固定，取材作常规石蜡切片，5μm左右的切片厚度，HE染色，在显微镜下对小鼠肝组织病理学变化进行观察。

1.5 统计学处理 数据经SPSS 20.0软件包统计分析，以（x±s）表示计量资料，行 t检验，采用百分比表示计数资料，行χ2检验。P＜0.05说明组间数据比较差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 南五味子多糖试验结果 经葡萄糖回归方程分析得出葡萄糖在40～200μg/ml范围内具有良好的线性关系，通过计算得出南五味子多糖含量为17.36%。急性毒性试验显示所有小鼠均正常，随着观察之间的增加小鼠体质量也随之增加，未出现死亡情况。

2.2 南五味子对小鼠脏器的影响 在实验中小鼠无异常活动表现，解剖小鼠未见脏器异常变化，空白对照组与其他给药组在脏器指数上比较无明显差异（P＞0.05）。 见表 1。

表1 南五味子对小鼠脏器影响比较（x±s）

2.3 南五味子对小鼠急性肝损伤保护作用 模型对照组AST、ALT水平对空白对照组显著更高（P＜0.05），南五味子多糖不同剂量的3个组与模型对照组比较ALT显著降低（P＜0.05），而高剂量和中剂量组AST水平显著降低（P＜0.05）。见表2。

表2 南五味子对小鼠急性肝损伤后ALT和AST的影响比较（x±s）

3 讨论

有毒物质所引起的肝脏损伤及各种病因导致的急性肝病可使肝细胞发生炎症或坏死，并继发纤维化的病理过程，因此要预防或延缓肝纤维化的形成就需要使各损伤因素减少，对肝细胞进行保护。临床研究认为五味子的活性成分能够抗癌、抗氧化、保肝等，其中北五味子多糖对于小鼠肝脏有显著的保护作用，能够使小鼠肝脏因四氯化碳造成的肝损伤减轻，不过对于南五味子多糖的急性毒性和保肝作用的相关研究较少，故而探究南五味子多糖急性毒性及对小鼠肝损伤保护作用具有重要意义[5，6]。

南五味子在中药护肝领域之中发挥了巨大作用，临床研究认为其具有以下作用：其一，南五味子能够促进胆汁的分泌，使肝内有毒物质加速排泄；其二，南五味子中富含多种活性成分，这些活性成分能够使SOD、GSH-Px等酶的生物活性增强，具有促进蛋白质生物合成、抗脂质过氧化、促进肝糖原生成、保护肝细胞膜等作用；其三，南五味子能够促进肝脏解毒过程，使肝脏受到良好保护，并能够使受损肝脏组织再生；其四，南五味子能够使外界因素导致肝组织中不断升高的转氨酶有效降低[7，8]。

本研究分析比较分析南五味子多糖急性毒性及对小鼠肝损伤保护作用机理，结果显示南五味子多糖能够使CC14致小鼠急性肝损伤后的ALT和AST水平明显降低，使小鼠肝脏损伤得到有效改善，证实了南五味子多糖对小鼠肝损伤有保护作用，同时急性毒性实验结果显示各组小鼠均未发生中毒情况，说明南五味子多糖还具有较高的用药安全性。

综上所述，南五味子多糖无明显的毒性作用，同时在一定程度上能够保护CC14致小鼠急性肝损伤。

[1]李振，孟宪纬，管延珍，等.南、北五味子提取物的抑菌及抗氧化作用研究[J].中国调味品，2017，42(1)：28-30.

[2]王华，刘天金，胡鹏，等.肝硬化大鼠诱导性多能干细胞移植对急性肝损伤的影响[J].江西医药，2012，47(4)：301-304.

[3]郭耀杰，郭豪杰，刘久石，等.异形南五味子化学成分和药理活性研究进展[J].中国现代中药，2017，19(3)：446-454.

[4]王陈萍，许波，蔡向明，等.不同五味子类木脂素成分对损伤肝细胞的保护作用比较[J].中国医药导报，2017，14(19)：35-38.

[5]李东良，李冰，张志强，等.五味子制剂对大鼠他克莫司血药浓度的影响及对肝损伤的防护作用 [J].中国临床药理学与治疗学，2015，20(3)：256-260.

[6]陈历，张凌云，赖春花，等.清肝抑脂汤对慢性肝损伤保护作用的研究[J].江西医药，2014，15(11)：1155-1158.

[7]邓鸣.异型南五味子总三萜小鼠急性毒性试验结果分析[J].深圳中西医结合杂志，2016，26(14)：186-187.

[8]林雄平，林彬彬，卓雄标，等.南五味子果实多糖和脂溶性物质抗菌抗氧化作用研究[J].安徽农业科学，2017，45(4)：119-121,168.