硬组织切片VG染色不良原因分析及对策

(西安空军军医大学西京医院全军骨科研究所 陕西 西安710032)

1 切片有黑色、蓝色杂质

1.1 分析[1](1)组织块取材时过大、过厚导致组织块内部固定液难以彻底冲洗干净；透明液渗透难、渗透慢、透明不彻底，造成黑色杂质，延长制片时间 。(2)载玻片没有擦洗干净，或被其他杂质污染，造成黑色杂质。(3)亚甲基蓝没有充分加热溶解，所残余的沉淀物导致有蓝色杂质(图 1)。

图1 左边黑色为金属材料，右边黑色颗粒为杂质，无形态结构的蓝色小点是亚甲基蓝没有充分加热溶解，残留的杂质。

1.2 应对[1](1)确定好要切片的方向，将组织用骨组织快速切割机(西安瑞丰仪器设备有限公司)锯成长2厘米的骨块，厚度尽量控制在1cm左右，以便液体容易渗透，缩短制片时间。流水冲洗时间由原来的30分钟延迟至1小时，将组织块内部的固定液彻底冲洗干净。(2)粘片用的树脂载玻片一定擦洗干净。(3)亚甲基蓝提前30分钟放入60℃水浴锅水浴，确保染液充分加热溶解再进行染色。

2 切片有气泡、空洞；切片边缘翘起，切片易折断

2.1分析(1)包埋过程中，组织块凝固时水浴锅提前打开加热，水浴锅温度调的过高，引起包埋液凝固过快、过猛，产生大量气泡。 (2)组织块在塑料液里浸泡时间过短，塑料液没有充分渗透到组织内部，切出的片子产生空洞。(3)粘片时502胶用量太多或太少，太多胶会溢出，太少切片不能完全粘住，边缘容易翘起，切片易折断。气泡的出现与粘片技巧也息息相关[2](图 2)。

图2 包埋和粘片过程中产生的气泡

2.2 应对(1)包埋用的甲基丙烯酸甲脂的聚合分为引发、发展、终止三个阶段，分子结构含有双键，产生活化中心，即游离基，这是引发阶段。单体活化中心进一步激发其他单体，产生新的活化中心，出现聚合反应，放出大量聚合热，此为发展阶段。最后失去活化中心而终止[3]。根据我们实验室多年来的经验，凝固过程中，先将带有包埋剂的组织块放入水浴锅，再打开水浴锅电源，逐渐升温，严格控制水浴温度，温度太低凝固过慢，太高会产生大量气泡，一般控制在45℃。水浴24小时组织块可完全凝固。(2)粘片时502胶的用量要适当，太少粘不牢，太多胶会溢出，一般小组织轻轻挤一小滴，大组织用力挤一大滴就可以，以刚好铺满片子为宜。用弯头小聂反复挤压几次，以挤出残留的气泡。(3)根据组织块大小决定浸泡塑料液的时间，硬组织切片需要分别浸泡塑料液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，一般每瓶液各泡3～5天，根据组织块大小决定浸泡塑料液的时间。让塑料液充分渗透到组织块内部，就不会出现空洞现象。

3 胶原纤维、类骨质，肌纤维形态结构不清楚；骨小梁颜色过深，成黑红色；颜色深浅不一。

3.1 分析(1)亚甲基蓝染色时间过长，导致颜色过深，甚至颜色发黑，胶原纤维、类骨质，肌纤维形态结构不清楚。(2)20%甲醇浸泡时间过长，骨小梁颜色由鲜亮的红色变成黑红色。(3)片子薄厚不均导致颜色深浅不一(图 3)。

图 3 亚甲基兰染色5分钟，软组织呈黑色，形态结构无法观察

3.2 应对(1)亚甲基蓝染色时间由原来五分钟缩短到三分钟(2)20%甲醇浸泡控制在2小时。(3) 磨片时掌握好力度，力求磨出的片子薄厚均匀。

4 切片有纵横交错的黑色细纹

4.1 分析 纵横交错的黑色细纹是用砂子磨片后抛光不彻底残留的划痕,影响图片美观(图 4)

图4 磨片后抛光不彻底，有划痕

4.2 应对(1)经我们实验室反复实验，选用TA805型齿科打磨抛光机，康齿宁牙齿抛光膏代替原来用三氯化铝抛光粉的手动抛光。抛光速度快、效果好，大大提高了效率。具体方法： 适量的康齿宁抛光膏和自来水混合，搅拌均匀，将切片在混合液里沾一下，双手扶稳切片，在抛光机上抛光，横向纵向重复此动作6～7次。(2)抛光后的切片需在显微镜下检查，仍有划痕，继续抛光，直至无划痕为止。

5 结果

切片的制作是一个连续的过错，环环相扣，每个环节都不能马虎，一个环节出现问题直接影响切片染色效果，通过以上各个环节的改进，大大提高了染色效果。切片完整、颜色鲜亮、 对比度明显、无杂质、无气泡、无空洞、无划痕(图 5)。

图5 经改进后的VG染色效果图

[1]范小莉，胥维勇，杨群，等. 陈思燏HE 染色不良的分析与应对方法[J]. 临床与实验病理学杂志, Clin Exp Pathol 2014 Jul; 30( 7).

[2]马恒辉, 周晓军. HE染色常见问题与对策[J]. 临床与实验病理学杂志,ClinExpPathol 2008 Aug;24(4).

[3]孟国林，吕荣，刘建，等． 骨科实验技术[M]． 北京:人民卫生出版社，2012，1(3):41．