不同浓度二甲双胍对人乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭和PTEN表达的影响及其机制

梁君伟，李青山，吕喜英，连相尧，刘兰芳，方志华

(1 承德医学院附属医院，河北承德067000；2 承德市第三医院)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率和死亡率明显上升，并且呈现明显年轻化趋势，发病率位居城市女性恶性肿瘤第一位，严重威胁女性健康和生活质量[1]。乳腺癌的发生发展机制尚未完全阐明，尽管手术和术后辅助治疗取得明显进步，乳腺癌患者的预后有了一定的改善，但乳腺癌仍具有较高的复发率[2]。近年来国内外研究[3]表明，二甲双胍除了降糖作用外，还具有明显抗肿瘤活性。体内及体外实验证实其能够抑制肿瘤细胞生长及侵袭、迁移能力，使其成为目前肿瘤学领域新的研究热点，但二甲双胍抗乳腺癌方面的研究较少，并且作用机制尚不清楚。第10号染色体缺失性磷酸酶-张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)是目前公认的抑癌基因之一，在包括乳腺癌在内的众多肿瘤中均起着明确的抑制肿瘤细胞生长的作用[4]。研究[5，6]表明，上调PTEN基因的表达水平能够显著抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭，并促进其凋亡。研究[7,8]发现，许多药物或化学合成物能够通过提高PTEN的表达水平从而发挥抗肿瘤作用。本研究观察不同浓度的二甲双胍对人乳腺癌细胞系SK-BR-3增殖、凋亡、侵袭及PTEN表达水平的影响，并探讨二甲双胍对乳腺癌细胞的调控机制。

1 材料与方法

1.1 二甲双胍、细胞及试剂 二甲双胍原药粉剂购自美国Sigma公司。人乳腺癌细胞系SK-BR-3购自美国ATCC公司。TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒购自大连宝生物公司，PTEN及内参β-actin引物购自广州锐博生物公司， CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物公司，Matrigel胶购自美国BD公司，Transwell小室购自美国Corning公司，Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司，一抗PTEN、β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养 SK-BR-3细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每2～3d换液1次，细胞呈单层贴壁生长，待融合度达90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 各组细胞增殖抑制率测算 采用CCK-8法。取生长状态良好的对数生长期SK-BR-3细胞接种于96孔板，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃原培养基，PBS清洗细胞。将SK-BR-3细胞分成4组，每组设5个平行孔，分别加入0、5、10、20 mmol/L的二甲双胍，记为0 mmol/L组、5 mmol/L组、10 mmol/L组、20 mmol/L组。各组细胞置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液后继续孵育3 h，酶标仪测定波长450 nm 处的OD值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-各组OD值450nm)/0 mmol/L组OD值450nm×100%。

1.4 各组细胞凋亡率测算 采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法。细胞分组及药物干预方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养48 h，PBS缓冲液洗涤细胞，胰蛋白酶消化后以无血清培养基重悬制备单细胞悬液。取细胞悬液置于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC，混合均匀后再加入5 μL PI，室温避光反应10 min后流式细胞仪检测，计算各组细胞凋亡率。

1.5 各组细胞侵袭能力检测 采用Transwell 侵袭实验。细胞分组及药物干预方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养48 h，PBS缓冲液洗涤细胞，胰蛋白酶消化后以无血清培养基重悬制备单细胞悬液。Matrigel胶4 ℃过夜融化，用不含血清的DMEM培养基按1:8稀释后，均匀涂抹至Transwell小室上室的通透膜。取各组细胞制备的单细胞悬液，于Transwell小室上室分别加入200 μL含有2×105个细胞的无血清DMEM培养基，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，常规培养24 h后取出小室，棉签擦拭去上室的细胞，4%多聚甲醛固定10 min，倒置、室温风干，0.1%结晶紫染色。在显微镜下随机取10个视野，计算穿过通透膜的细胞数目，以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。

1.6 各组细胞PTEN mRNA检测 采用qRT-PCR法。细胞分组及药物干预方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养48 h，应用TRIzol试剂按说明书操作提取细胞总RNA，取5 ng总RNA应用逆转录试剂盒逆转录得到cDNA。以cDNA为模板，参照qRT-PCR试剂盒说明书配制PCR反应体系，以β-actin为内参进行PCR扩增。引物序列：PTEN上游引物为5′-TTGTGGCAACAGCTGAATCTGCAGTTGGCTAAGAGAGGTT-3′，下游引物为5′-ATGTAGCAAAACCCTTCGGAAACCTCTCTTA-GCCAACTGC-3′；内参β-actin上游引物为5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物为5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。PCR反应条件：95 ℃ 30s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。用2-△△Ct表示各组细胞中PTEN mRNA的相对表达量。

1.7 各组细胞PTEN蛋白检测 采用Western blotting法。细胞分组及药物干预方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养48 h，PBS洗涤细胞，应用预冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min离心15 min后提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量法测定各组细胞蛋白浓度。按每孔50 μg蛋白上样，10% SDS-PAGE电泳分离，蛋白质电转至硝酸纤维素膜上，5%的脱脂牛奶封闭2 h，分别加入合适浓度的一抗PTEN单克隆抗体(浓度1∶1 000)或β-actin单克隆抗体(浓度1∶3 000)，4 ℃摇床轻摇孵育过夜，漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(浓度1∶5 000)，ECL化学发光、显影、定影、压片、灰度扫描，以灰度值表示PTEN蛋白的相对表达水平，以β-actin 校正。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 0 mmol/L组、5 mmol/L组、10 mmol/L组、20 mmol/L组细胞增殖抑制率分别为0.0%±0.0%、23.7%±2.2%、43.2%±2.9%、63.9%±5.6%，组间相比，P均<0.05，提示二甲双胍对SK-BR-3细胞增殖有明显的抑制作用，且细胞增殖抑制作用具有一定的浓度依赖性。

2.2 各组细胞凋亡率比较 0 mmol/L组、5 mmol/L组、10 mmol/L组、20 mmol/L组细胞凋亡率分别为5.1%±0.2%、18.2%±1.9%、26.3%±2.0%、40.1%±2.6%，组间相比，P均<0.05，提示二甲双胍对SK-BR-3细胞凋亡有明显的促进作用，且细胞凋亡促进作用具有一定的浓度依赖性。

2.3 各组细胞侵袭能力比较 0 mmol/L组、5 mmol/L组、10 mmol/L组、20 mmol/L组细胞穿膜细胞数分别为(170±23)个、(112±14)个、(74±9)个、(30±5)个，组间相比，P均<0.05，提示二甲双胍对SK-BR-3细胞侵袭能力有明显的抑制作用，且细胞侵袭能力抑制作用具有一定的浓度依赖性。

2.4 各组细胞PTEN mRNA和蛋白表达比较 0 mmol/L组、5 mmol/L组、10 mmol/L组、20 mmol/L组细胞PTEN mRNA的相对表达量分别为1.01±0.04、2.89±0.27、4.12±0.23、5.45±0.49，PTEN蛋白的相对表达水平分别为0.13±0.05、0.41±0.06、0.61±0.10、0.94±0.11，组间相比，P均<0.05，提示二甲双胍能够上调SK-BR-3细胞PTEN mRNA和蛋白的表达，且表达上调作用具有一定的浓度依赖性。

3 讨论

研究[9]显示，胰岛素抵抗和高血糖症明显增加乳腺癌的发病风险，特别是对于绝经后合并体质量超重的患者。研究[10]表明，合并糖尿病的乳腺癌患者生存期明显短于未合并糖尿病的患者。二甲双胍是目前临床广泛应用的治疗2型糖尿病的一线降糖药物。近年来研究[11]证实,二甲双胍可降低2型糖尿病患者肿瘤发病风险及肿瘤相关死亡率。在乳腺癌的研究[12]中也证实，二甲双胍可降低2型糖尿病患者乳腺癌的发病率。Jiralerspong等[13]发现，合并糖尿病的乳腺癌患者，服用二甲双胍患者的预后明显优于未服用二甲双胍者，但至今二甲双胍对乳腺癌发生及预后影响的具体作用机制尚未明确。

乳腺细胞的异常增生、凋亡受阻、侵袭增强是导致乳腺癌发生发展的主要因素。抑制癌细胞的增殖和侵袭并诱导其凋亡，是目前药物治疗恶性肿瘤重要的作用机制之一。近年有研究[14]证实，二甲双胍能够抑制肿瘤生长和增殖，并且能够减小荷瘤裸鼠的肿瘤体积，且对机体正常细胞不产生破坏作用，在抗肿瘤方面具有很大的应用前景，引起了学者的关注。但二甲双胍对乳腺癌生长、侵袭影响的研究较少。本研究用不同浓度的二甲双胍处理人乳腺癌SK-BR-3细胞后，检测结果显示，二甲双胍对SK-BR-3细胞的增殖和侵袭有着明显的抑制作用，对SK-BR-3细胞的凋亡有着明显的促进作用，提示二甲双胍对乳腺癌细胞的生长有着明显抑制作用，并且这些作用都具有一定的浓度依赖性，随着二甲双胍浓度的增高，作用逐渐增强。

目前有关二甲双胍对乳腺癌细胞生长侵袭抑制作用的具体作用机制尚不清楚。近年研究[15,16]发现，二甲双胍在胃癌、肾细胞癌等多种恶性肿瘤中可以上调PTEN的表达而发挥抑癌基因的作用。PETN基因位于染色体10q2313上，含有9个外显子和8个内含子，是至今发现的惟一具有磷酸酶活性和蛋白脂酶活性的抑癌基因。研究[17]发现,PETN能够通过调控PI3K/AKT、FAK/P130CAS、SHC/Gab、P53/MDM2、PRAP/mTOR、RAS/ERK等机体多个重要信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、侵袭和迁移的调控。研究[18]显示，50%的乳腺癌患者存在PTEN基因缺失、突变或者启动子甲基化。Stambolic等[19]在研究中发现，条件性敲除PTEN基因的雌性小鼠，49%在6个月后发生乳腺癌。提高乳腺癌细胞PTEN基因的表达水平能够抑制乳腺癌细胞的增殖及侵袭迁移，并促进其凋亡[20]。在对耐药性乳腺癌细胞的研究[21]中发现，提高PTEN基因的表达可以明显提高乳腺癌细胞对化疗药物阿霉素的敏感性。本研究发现，二甲双胍能够明显上调乳腺癌细胞PTEN mRNA和蛋白的表达，并且对PTEN mRNA和蛋白表达的上调作用具有一定的浓度依赖性，随着二甲双胍浓度的增高，作用逐渐增强，说明二甲双胍能够通过上调PTEN基因的表达水平发挥抑制乳腺癌细胞生长侵袭的作用。

综上所述，二甲双胍能够明显抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，促进其凋亡，对乳腺癌细胞的生长起着明显的抑制作用，并且抑制作用与二甲双胍浓度有关，其机制可能与上调PTEN的表达有关。