胃癌组织中miR-218和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin mRNA的表达观察

檀碧波，李勇，赵群，范立侨，赵雪峰

(河北医科大学第四医院，石家庄050011)

胃癌是我国常见恶性肿瘤，治疗效果不理想、预后差。在胃癌进展过程中，胃癌细胞由于具有较强的凋亡抵抗能力，使胃癌细胞不易死亡，是胃癌生长及转移的重要原因。在胃癌的凋亡抵抗形成过程中，多种分子组成的网络式调控发挥了作用，探讨关键分子在胃癌凋亡中的作用对阐明胃癌进展机制、胃癌评价及治疗思路的改进有重要价值，但迄今相关的研究[1,2]还没有突破性进展。报道[3,4]显示，微小RNA-218(miR-218)在胃癌细胞中表达降低，能调控胃癌细胞的增殖、侵袭能力，但有关miR-218与胃癌细胞凋亡的关系及其预后价值分析的报道少见。本研究对胃癌组织中miR-218和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、x染色体连锁凋亡抑制因子(xIAP)、生存素(Survivin)的表达水平及相关性进行了观察，分析miR-218表达与胃癌患者临床病理参数及预后的关系，探讨miR-218作为胃癌预后标志物的可行性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2012年1月～2012年12月在河北医科大学第四医院接受手术治疗的胃癌患者80例，其中男55例、女25例，年龄38～78岁，中位年龄60岁。纳入标准：①年龄≥18岁；②确诊为胃癌，手术切除了原发肿瘤；③患者手术前未接受放化疗或靶向治疗等针对肿瘤的治疗。排除标准：①合并其他恶性肿瘤或严重的免疫或内分泌系统疾病；②复发或转移的患者。手术过程中留取癌组织及癌旁组织(距离癌组织边缘>3 cm)，癌组织均经病理学检查证实为胃癌，癌旁组织均经病理检查为胃黏膜组织，无癌及不典型增生组织。患者均有完整的病历记录及随访资料，随访截止日期2017年1月。

1.2 基因引物、试剂与仪器 miR-218及Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin基因和内参基因(U6、GAPDH)的引物序列由上海生工生物公司合成。TaqMan Real-Time PCR试剂盒为美国Applied Biosystems公司产品。PCR试剂及反转录试剂盒为美国Invirtogen公司产品。Real-Time PCR仪(AB-7900型)为美国Thermo Fisher公司产品。

1.3 受检组织中miR-218和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin的mRNA检测方法 受检组织加入TRIzol试剂提取总RNA，用分光光度计测定其浓度及纯度。测定完毕后进行逆转录，合成各靶基因的cDNA单链，然后取2 μL的cDNA进行PCR反应。按TaqMan Real-Time PCR试剂盒说明书进行操作，以U6为内参，检测miR-218的表达；按PCR试剂盒说明书进行操作，以GAPDH为内参，检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin的mRNA的表达。引物序列如下：Bcl-2上游引物为5′- TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3′,下游引物为5′- TGGATCCAGGTGTGCAGGT -3′；Bax上游引物为5′- TTTCTGACGGCAACTTCAAC -3′,下游引物为5′- AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3′；xIAP上游引物为5′- CCGTGCGGTGCTTTAGTTGT -3′,下游引物为5′- TTCCTCGGGTATATGGTGTCTGAT -3′；Survivin上游引物为5′- GCCAGATTTGAATCGCGGGA -3′,下游引物为5′- GCAGTGGATGAAGCCAGCCT -3′；GAPDH上游引物为5′- GACCCCTTCATTGACCTCAAC -3′,下游引物为5′- CGCTCCTGGAAGATGGTGAT -3′；U6上游引物为5′- CTCGCTTCGGCAGCACA3 -3′,下游引物为5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT3 -3′。建立20 μL的PCR反应体系，包括10 μL miRcute miRNA Premix(检测miR-218)或SYBR Green Mix(检测Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin)、上下游引物各0.5 μL、反转录产物2 μL、DEPC处理水7 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸32 s，40个循环。用2-ΔΔCt表示受检组织中miR-218或Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin的mRNA相对表达量，以miR-218或Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin mRNA的相对表达量与内参U6或GAPDH的相对表达量的比值代表目的分子的相对表达强度。以胃癌组织中miR-218相对表达强度的平均值为界，将胃癌患者分为miR-218高表达组与miR-218低表达组，对比分析其临床病理参数及预后。

2 结果

2.1 胃癌组织、癌旁组织中miR-218、Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin mRNA的相对表达强度比较及其在胃癌组织中表达的相关性 胃癌组织中miR-218和Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin mRNA 的相对表达强度分别为0.307 7±0.118 1、0.817 7±0.272 6、0.248 1±0.110 8、0.599 5±0.261 3、0.820 9±0.342 6，癌旁组织分别为0.565 9±0.226 0、0.277 4±0.116 7、0.444 4±0.201 9、0.298 7±0.147 8、0.247 0±0.112 2，两种组织各指标相比，P均<0.01。

胃癌组织中miR-218与Bcl-2 mRNA的表达呈负相关(r=-0.341,P<0.01)，miR-218与Bax mRNA的表达呈正相关(r=0.522,P<0.01)，Bcl-2 mRNA与Bax mRNA的表达呈负相关(r=-0.439,P<0.01)，Bcl-2 mRNA与Survivin mRNA的表达呈正相关(r=0.235,P<0.01)。

2.2 胃癌组织中miR-218高低表达者临床病理参数及预后比较 80例胃癌患者中，胃癌组织中miR-218高表达组42例、低表达组38例。在42例胃癌组织miR-218高表达组患者中，男26例、女16例，年龄≥60岁25例、<60岁17例，肿瘤直径≥5 cm 23例、<5 cm 19例，浆膜内浸润15例、浆膜外浸润27例，TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期21例、Ⅲ期+Ⅳ期21例，中高分化26例、低分化16例，淋巴结转移者29例，远处转移者5例。在38例胃癌组织miR-218低表达组患者中，男29例、女9例，年龄≥60岁16例、<60岁22例，肿瘤直径≥5 cm 26例、<5 cm 12例，浆膜内浸润18例、浆膜外浸润20例，TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期9例、Ⅲ期+Ⅳ期29例，中高分化22例、低分化16例，淋巴结转移者34例，远处转移者3例。对比两组患者的临床病理参数，结果显示，胃癌组织中miR-218的高低表达与TNM分期和淋巴结转移有关(P均<0.05)，与性别、年龄、肿瘤直径、浸润深度、分化程度、远处转移无关(P均>0.05)。

胃癌组织中miR-218高表达组、低表达组的5年生存率分别为66.67%、28.95%，两组相比，χ2=9.789，P<0.01。

3 讨论

胃癌的发病率、死亡率在我国居各种恶性肿瘤的前列，该病起病隐匿、进展快、预后差，患者就诊时大多已处于进展期，综合治疗效果不理想[5,6]。胃癌进展快的原因在于胃癌细胞具有较强的增殖能力、侵袭迁移能力及凋亡抵抗能力，使胃癌易于进展及转移,其中胃癌细胞的凋亡抵抗能力发挥了重要作用[7]。凋亡抵抗能力使胃癌细胞具有较强的生存能力，且可以影响以诱导凋亡为作用机制的化疗药物的效果[8]。胃癌凋亡抵抗的能力是由多种基因共同作用而形成的，如能通过分子调控减轻胃癌细胞的凋亡抵抗能力，则有可能改善胃癌的综合治疗效果，从而改善患者的预后。在胃癌的分子调控过程中，近年来miRNA已受到越来越多的关注，并在胃癌研究中取得了很多成果。miRNA的作用极为广泛，参与了生物体的各种生命现象，如发育﹑细胞分化﹑增殖和凋亡等[9]。miRNA的作用在于它能调控成组的靶基因，因而与单个基因相比，miRNA具有更为强大的调控功能。研究[10]表明，miR-218在多种恶性肿瘤中异常表达，在胃癌中也存在表达降低，并与胃癌的侵袭迁移有关，但有关miR-218与胃癌凋亡及其预后的报道少见。本研究显示，胃癌组织中miR-218相对表达强度明显低于癌旁组织，miR-218相对表达强度与临床分期、淋巴结转移有关，进一步研究发现miR-218低表达者的预后比高表达者差，提示miR-218可能作为预后因子对胃癌患者进行预后评价。

为分析miR-218的作用机制，本研究同时检测了凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、xIAP、Survivin的mRNA表达。Bcl-2是线粒体凋亡途径的重要基因，可以通过改变线粒体的膜电位而抑制细胞凋亡，还可以通过改变线粒体膜的通透性将凋亡蛋白前体Apaf-1固定在线粒体膜上等机制而抑制细胞凋亡[11]。Bax则是促凋亡基因，可与Bcl-2结合成二聚体，通过二者的比例变化而影响细胞的凋亡[12]。xIAP、Survivin都是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成员，都具有较强的凋亡抑制作用，可以通过抑制半胱天冬酶的活性而发挥作用[13]。本研究显示，胃癌组织中Bcl-2、xIAP、Survivin的mRNA均高于癌旁正常组织，而Bax 表达则低于癌旁正常组织，与相关报道一致[14～16]。相关分析显示，miR-218与Bcl-2表达存负相关关系，miR-218与Bax表达存在正相关关系，Bcl-2与Bax表达存在负相关关系，Bcl-2与Survivin表达存在正相关关系，这些结果提示miR-218可能通过调控Bcl-2而发挥了作用，但具体情况还有待体内外实验证实。

综上所述，本研究证实胃癌组织中miR-218低表达，miR-218可能通过参与Bcl-2、Bax、Survivin基因表达的相互调节而参与肿瘤细胞凋亡过程；胃癌组织中miR-218低表达预示肿瘤处于较高临床分期、淋巴结转移可能性较大，且miR-218低表达是胃癌患者预后差的重要标志。