2种人工诱导玉米孤雌生殖育种方法的比较

张广峰，卢保红，孟丽霞，魏荣业，杜如珊，程 宏

（1.山西省农业科学院玉米研究所，山西 忻州 034000；2.五台县气象局，山西 五台 035500）

优良玉米自交系的选育是玉米杂交育种的基础和关键，在常规选育玉米自交系过程中，要得到一个比较稳定的纯系需要7～8代，耗时长，人力、物力投入多，且不能达到完全纯合，而玉米孤雌生殖育种方法以其能快速、稳定地获得完全纯合自交系的优势，无可争议地成为各国玉米育种的重要手段。现阶段，诱导玉米孤雌生殖的方法主要有化学药剂和诱导系杂交2种。本研究分别从二者的机理、过程、影响因素等方面进行综述，分析了其在实际应用中各自的优劣点及适用条件，以期为玉米孤雌生殖育种实践提供指导。

1 化学方法诱导玉米孤雌生殖

1.1 化学方法诱导玉米孤雌生殖的相关机理

关于化学药剂诱导玉米进行孤雌生殖得到种子的来源和过程，至今还没有统一的、明确的观点能够阐释。其中，关于二倍体胚的来源，业内目前主要有2种推论：一是单倍体的卵细胞经过自然加倍、核内复制形成二倍体胚（如卵细胞单独开始分裂就会形成单倍体胚，最后成为单倍体种子，单倍体与二倍体植株可由其形状区分）[1]，二是未进行减数分裂的卵细胞[2-3]。对于二倍体胚乳的来源同样有2种推测：一是类似其他植物的无融合生殖即极核没有经过受精而直接发育形成胚乳[4-6]，二是由珠心细胞经过一系列发育而成胚乳。

1.2 化学方法诱导玉米孤雌生殖的影响因素

1.2.1 不同处理方法和时期 化学药剂诱导玉米孤雌生殖的方法主要有：（1）喷施法。即在雌穗吐丝前，选取健壮、无病虫害的植株雌穗进行人工套袋，并去除套袋株及附近植株的雄穗。在花丝长约2～4 cm时，于早晨未散粉前取下套袋，将药液均匀喷洒在花丝上，之后再次套袋并固定在果穗上[7]。（2）注射法。即在雌穗吐丝前，选取健壮、无病虫害的植株雌穗进行人工套袋，在果穗长8～10 cm时，取下套袋，剪去顶部3～5 cm的苞叶，将装有药液的注射器针头从可见花丝处中央微微插入并注入1～2滴药液后再次套袋，同时固定在果穗上[8]。在实际操作中喷施法与注射法各有优劣[9]：喷施法在结实率方面表现更好，且操作简单，缺点是杂株率较高，如具备隔离条件，使用喷施法效果较好；使用注射法时基本没有杂株，但结实率比喷施法要低，不具备隔离条件时，应使用注射法并适当增加注射次数（2～3次）[10]。

1.2.2 不同基因型及基因纯合度的影响 很多研究表明，化学药物诱导不同基因型玉米材料进行孤雌生殖的频率差异显著[11-13]。于运凯[10]研究表明，诱导不同基因型玉米材料进行孤雌生殖的频率大小顺序为兰卡群＞黄早群＞瑞德群，并且相对于其他影响因素而言，基因型的影响效果是最大的。研究还发现，药物诱导自交系的孤雌生殖频率比较低，而杂交种相对较高，说明基因的纯合度或杂合性与孤雌生殖诱导有关，其诱导效果大小顺序为：群体＞杂交组合＞育种中间材料＞自交系[14]。

1.2.3 药剂及其浓度 国内外研究人员经过多年的试验研究，结果表明，多种药物能够诱导玉米进行孤雌生殖，其中，诱导频率较高、结实好的药剂主要有秋水仙碱（COL）、二甲基亚砜（DMSO）、马来酰胼（MH）等。HU等[15]通过试验得出，诱导效果最好的药剂及其浓度组合为0.01%DMSO和0.01%DMSO＋0.01%甲烷磺酸。而石太渊等[16]的研究认为，2%DMSO＋40 mg/kgMH＋0.1%COL的诱导效果最好。目前，对于诱导剂及最佳浓度的问题还没有统一的定论，有待进一步研究。

1.3 化学药剂诱导玉米孤雌生殖育种技术的优势与应用

1.3.1 缩短育种时间 药物诱导玉米孤雌生殖在当代就可获得纯合二倍体，再经扩繁、鉴定，2～3 a即可形成纯系并进入育种阶段，较之常规选育自交系极大地缩短了时间。

1.3.2 精确选择目标性状 孤雌生殖个体的选择本质上是单倍体的选择，因此，极大地提高了目的性状选择概率[17]，从而使得早期测配更加准确。

1.3.3 选择范围广 与其他育种方法相比，药物诱导孤雌生殖对于不同基因型甚至高度杂合的、发生疯狂分离的远缘杂种均有效果[18]，使得物种间的基因交流更加容易，进而达到创制新种质的目的。

1.3.4 操作简便 该技术操作简单，一般人员稍加培训均可掌握。

1.3.5 固定杂种优势 孤雌生殖产生二倍体是一种固定杂种优势的有效途径。

1.4 化学药剂诱导玉米孤雌生殖育种技术中存在的问题

1.4.1 最佳诱导剂和浓度未有定论 虽然已有众多研究人员对诱导剂和浓度进行了试验并得到了一些数据，但结果并不一致，加之诱导率普遍偏低，导致该技术没有能够被广泛应用。因此，最佳诱导剂和浓度问题仍需进一步研究。

1.4.2 诱导结果差异明显 通过化学诱导获得的后代，并不全都理想，除了有明显的分离现象外[11，19]，还含有非整倍体、杂合体等个体，表现并不完全稳定[7，14]。

1.4.3 鉴定方法不完善 目前对孤雌生殖体的鉴定[20-21]，还没有统一、权威、准确的方法。

2 诱导系杂交诱导玉米孤雌生殖技术

2.1 诱导系诱导玉米孤雌生殖产生单倍体的相关机理

孤雌生殖诱导系是指可以作为父本杂交诱导母本得到远高于自然频率单倍体的纯合系。1941年COE[22]将1份具有红色叶耳、白色胚乳、紫色糊粉层、硬粒型特殊性状的晚熟玉米材料用作色素研究，并在1950年将此材料命名为Stock6，将其作为父本对其他系杂交时可以产生1%～2%的单倍体。Stock6诱导产生单倍体的原理是双受精过程中一个精核与2个极核结合形成正常胚乳，而另一个精核不能与卵细胞结合形成受精卵，从而发育成单倍体胚[23]。

2.2 诱导系的发展

除Stock6外，国外研究人员还相继改良培育出了A358，ZMS，MKS，MHI等单倍体诱导材料，都可以产生3%以上的单倍体胚。

我国研究人员也对Stock6进行了改良、选育。中国农业大学的刘志增等[24]利用BHO（高油群体）与Stock6杂交，经多代杂交选育出农大高诱1号，其诱导率达5%～6%；吉林省农业科学院的才卓等[25]育成的吉高诱3号，平均诱导率可达10%以上。

2.3 诱导系杂交诱导的过程

2.3.1 基础群体的组建 基础群体是准备作为母本与诱导系杂交的基础材料，其将直接决定最终所产生DH系的各种性状，因此，组建基础群体是关系到孤雌生殖单倍体育种成功的决定性环节。

2.3.2 母本世代的选择 低代材料具有吐丝期集中、果穗较大、基因丰富、便于诱导的优点，因此，诱导系诱导杂交的母本大多选择低代材料。

2.3.3 杂交诱导 杂交诱导有人工诱导和自然诱导2种方式，其中，人工诱导就是以诱导系为父本，以组建的目标群体为母本进行的杂交，小规模、无隔离条件时选择人工诱导；自然诱导类似于大田制种，要具备隔离条件，父、母本的比例为1∶3或2∶4左右，种植前一定要测算好父、母本的花期以确定各自播期，面积较大时选择自然诱导。人工诱导相比自然诱导的缺点是结实不好、费工、费时、易混杂，如条件许可，应选择自然诱导的方式。

2.3.4 单倍体的鉴定与挑选 单倍体的鉴定方法主要有：细胞遗传学方法、形态学和解剖学方法、放射性法、分子标记法、遗传标记法。实际操作时可根据自身情况选择一种或几种方法实施。

2.3.5 单倍体的加倍

2.3.5.1 自然加倍 自然加倍就是将单倍体种子不经处理直接播于田间，在自然条件下生长、授粉、收获。其加倍率低，仅为1%～5%，在土地、水肥等环境条件较好时，加倍率可以得到显著提高。

2.3.5.2 人工加倍 不能进行自然加倍的一些单倍体材料，可以采用人工加倍的方法进行。人工加倍就是利用一些化学的、物理的方法处理单倍体材料，以达到单倍体加倍的方法。目前利用较多的是以秋水仙素和除草剂等化学药物处理的化学加倍，效果较好的化学加倍方法主要有浸种法、注射法、浸芽法等。

2.3.6 双单倍体系的评价 玉米单倍体加倍后所得籽粒一般不多，因此，需对其进行扩繁，之后依据DH系植株、穗部、籽粒等性状指标进行鉴定、评价，初步选择符合自身育种目标的DH系进行下一步的测交与产量测试，并再次进行鉴定、淘汰，最后选出符合育种目标的DH系。

2.4 诱导系杂交诱导玉米孤雌生殖技术的优势与应用

2.4.1 快速选育纯合系及提纯亲本 孤雌生殖诱导系诱导玉米单倍体育种方法一般只需2代即可得到纯合的重组二倍体，且这种二倍体理论上是100%的纯合。在玉米种子生产过程中，亲本经过多年繁育后会有退化和混杂的现象，其将直接影响到杂交种的纯度和原本性状，利用单倍体技术可对其进行提纯和保持优良特性。

2.4.2 群体改良 采用常规育种法改良玉米群体周期长、效率低。而单倍体育种技术不仅可以提高改良的效率，还可以简化基因互作、消除超显性效应、淘汰不良隐性基因的影响，从而加大选择的目的性，因此是群体改良的重要补充方法。

2.4.3 遗传学研究 双单倍体群体还可用于一些遗传简单的基因定位及克隆，构建遗传图谱，在遗传学上有重要的研究价值。

2.5 诱导系诱导玉米孤雌生殖的影响因素

2.5.1 不同母本基因型对单倍体诱导率的影响有研究表明，同一诱导系杂交诱导不同基因型母本间的单倍体诱导率差异较大，但不同遗传背景或杂种优势类群材料与单倍体诱导率之间的关系仍不明确[26]。

2.5.2 不同环境对单倍体诱导率的影响 不同环境对诱导单倍体的结果影响较大：环境较差的诱导率仅2.0%，而环境理想的诱导率可达16.4%[27]。在海南冬季的单倍体诱导率明显高于我国北方地区[25]。

2.5.3 不同花丝长度对单倍体诱导率的影响 有研究表明，长花丝（7 cm以上）的平均诱导率明显大于短花丝（4 cm以下）的平均诱导率[28]。

2.5.4 不同授粉时期对单倍体诱导效率的影响有研究表明，伏后授粉平均诱导率明显大于伏期授粉的平均诱导率[28]。

2.6 诱导系杂交诱导玉米孤雌生殖育种技术中存在的问题

2.6.1 缺乏优良诱导系 当前，配合力强、标记明显且诱导率高的诱导系仍然缺少，选育优良诱导系是诱导玉米单倍体育种技术的重点研究方向[24-25]。

2.6.2 难以组建足够数量的基础材料 基础材料的选择是单倍体育种工作成效的决定要素，因其与单倍体的诱导率及加倍率均显著相关，并直接决定双单倍体的各种性状。

2.6.3 诱导率和加倍率偏低 目前，虽然单倍体的诱导率及加倍率均有所提高，但由于技术本身的特殊性，受到多种因素影响，二者效率仍然低下，提高诱导率和加倍率仍是单倍体技术的重点、难点。

2.6.4 加倍材料的管理工作量大 单倍体植株生长健壮对育性的恢复非常重要。由于其生长的特殊性，对环境要求较高，因此，一定要保证其生长所需的土、肥、水、热等条件；田间除草、去杂要贯穿整个生育期；单倍体一般为雄性不育与雌雄不协调，因此，单倍体授粉需仔细观察、多次精细授粉，才能保证结实，其授粉过程比正常植株要复杂、困难较多。

3 结论与讨论

孤雌生殖育种技术在玉米育种中的应用前景十分广阔。其可以快速有效地累积目标材料中有利的双亲互补基因，达到群体材料遗传重组与改良的目的；还可以聚合足够多的有利基因位点，利用单倍体技术使优良的基因快速纯合，获得性状优良的纯系，进而提高玉米育种的效率，该方法将会成为改良自交系的主要方法。

玉米孤雌生殖现象是极其复杂的生理、生化过程。化学药物诱导玉米孤雌生殖可以极大地提高结实率，但由于材料和药物不同，具体到平均结实率又高低不一，诱导效果也随所用药物的不同而不同，普遍认可的药物及浓度组合为0.01%DMSO与0.01%DMSO＋0.01%甲烷磺酸；药物使用方法以注射略好，可能与药物与胚囊接触时间的长短有关；材料基因型与纯合度也造成了诱导效果的显著不同，其大小顺序为群体＞杂交组合＞中间育种材料＞自交系，说明材料的纯合度与诱导效果呈负相关。诱导系诱导玉米孤雌生殖的方法简便易行，影响其结果的主要因素有：同一诱导系诱导遗传背景或杂种优势类群材料间的诱导率差异较大，但具体关系仍不明确；不同环境对诱导的结果影响较大，如在我国海南冬季的单倍体诱导率明显高于北方地区；长花丝的平均诱导率明显大于短花丝的平均诱导率；伏后授粉平均诱导率明显大于伏期授粉的平均诱导率。因此，利用玉米孤雌生殖技术选育纯合系时，上述因素均应考虑。

化学药剂和诱导系杂交诱导2种方法均是玉米进行孤雌生殖育种的有效方法，2种方法各有利弊，在实际应用中，研究人员应根据自己的材料、人力、物力、土地等条件的具体情况来选择合适的方法，避免资源浪费和试验失败。

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