EMS诱变及其在构建花生突变体库中的应用

杨秀丽，杨丽萍，宁东贤，赵玉坤，李 楠

（山西省农业科学院小麦研究所，山西 临汾 041000）

花生是我国重要油料作物之一，种植面积近466.7万hm2，占全球的29%，总产居国内五大油料作物之首。在我国，花生的消费主体是榨油，为了满足市场对花生油的需求、提高花生食品品质、延长货架寿命，选育优质专用型花生成为花生育种的主要方向。

在我国，几乎每年都有一些新育成的花生品种被推向市场，但绝大多数推广品种的亲本是“伏花生”和“狮头企”，或者是含有它们的血缘[1]。优势新品种的选育决定于作物遗传基因多样性的丰富度，过多使用遗传背景相同或相似的亲本材料，会导致栽培种花生基因的大量流失，其遗传基础日益狭窄、遗传变异率低，使得有性杂交重组中无法创造新的基因变异，优异性状的产生受到限制，无法获得在农艺性状和品质上突出的花生品种[2]。另外，花生是自花授粉作物，它的四倍体栽培种与其二倍体野生种之间存在的倍性差异以及远缘杂交不亲和性，阻碍了它们之间的基因交流，使得花生选育工作很难有突破性的进展[3]。因此，在花生遗传育种工程中，需要一种有效方法来解决这些问题，创制出农艺性状优良、适应性强、配合力高和遗传基础广泛的优异新种质。

化学诱变育种周期短、进程快、可以获得大量的变异性状，这些特点是常规育种所不具备的。化学诱变育种利用诱变剂处理作物的花粉、种子、芽或茎秆等，发生诱变的后代产生可遗传的变异，育种家根据育种目标，对突变体进行鉴定和筛选，最终选育出遗传稳定的新品系或新品种[4-5]。在作物育种中，常用的化学诱变剂有甲基磺酸乙酯（EMS）、叠氮化钠（NaN3）和平阳霉素（PYM）。EMS是一种高效、稳定和良好的化学诱变剂，目前在诱变育种中应用最广泛、效果也最好。

1 EMS诱变原理与特点

EMS（Ethyl Methane Sulfonate，甲基磺酸乙酯）分子式CH3SO2OC2H5，分子量124，无色液体，水中溶解度为8%，pH值7条件下在水中半衰期20℃时是93 h，30℃时26 h。EMS是一种烷化剂，它带有1个或多个活性烷基，这些基团能够转移到一个电子密度高的分子上，置换碱基中的氢原子。EMS是通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变的，当鸟嘌呤G的N-7位置被烷基化，成为一个带正电荷的季铵集团，进而发生2种遗传效应：一是烷化的鸟嘌呤（G）与胸腺嘧啶（T）配对，代替胞嘧啶（C），发生转换型的突变；二是由于N7烷基活化，糖苷键断裂造成脱嘌呤，而后在DNA复制过程中，烷基化鸟嘌呤（G）与胸腺嘧啶（T）配对，导致碱基的转换或颠换，即原来的G∶C对可以变为任何碱基对 G∶C，C∶G，A∶T，T∶A[6-7]。这种单一碱基对的改变形成了点突变。

EMS被认为是目前化学诱变效果最好而负面影响相对较少的诱变剂，它具备3个特性：一是高突变频率和相对较少的染色体畸变，易于后代突变体的筛选；二是试验材料受到的损伤相对较轻；三是EMS具有强烈的挥发性与致癌性[8]。

2 EMS诱变材料与方法

EMS诱变育种存在2个关键环节，一是选择合适的供试材料；二是采用有效的处理方法。供试材料的不同将会引起诱变效率和后代筛选难度的不同，而有效的处理方法会在保证诱变剂高效渗入诱变部位的同时，作物的进一步生长和发育不会受到制约，最终产生突变个体，完成育种过程。

2.1 诱变材料

研究者通常根据作物的繁殖方式和染色体倍数来选择诱变的部位，比如种子、花药、花粉、块茎和叶片等，一般农作物的化学诱变最常用的供试材料是种子和花粉。诱变材料的处理途径根据供试材料的不同有所差别，常用的途径有浸泡法（种子、芽）、滴液法（茎）、注射法（花器）、涂抹法（花丝、茎）和共培养法（根、花药）等。EMS诱变花生通常用种子作为供试材料，也有将EMS直接注入花生花器或涂抹果针的方法来获得诱变体。SIVARAM等[9-10]用EMS处理花生种子，均选育出高产品系。FANG等[11]通过EMS诱变处理花生种子，筛选出了1个油酸含量高达60%以上的弗吉尼亚型花生突变体e2-4-83-12。殷冬梅等[12]选择一片子叶但保留完整的花生胚作为种子外植体进行EMS诱变，确定了不同品种的适宜诱变组合。王传堂等[13]将EMS直接注入花生开放花朵的龙骨瓣内，获得了超大果和超小果的突变体，种子的蛋白质含量和粗脂肪含量有明显提高。鲁花12号是用EMS处理杂交组合的F1果针诱变育成的[14]。

2.2 诱变方法

构建花生突变体库中，要获得良好的诱变效果，操作者除了选择合适的诱变材料外，更重要的是选用适宜的诱变剂量（诱变剂量＝诱变液浓度×处理时间），最佳诱变剂量取决于EMS诱变浓度和处理时间的组合。此外，温度和pH值对诱变效应也有影响。

花生栽培种具有4种基因型，分别是普通型、珍珠豆型、多粒型和龙生型。育种家已经对前3种类型进行了一些化学诱变的研究，结果表明，不同的基因型对诱变剂的响应是存在差异的，在半致死量的条件下，不同基因型的诱变剂量是不一致的。一般情况下，随着EMS溶液浓度的提高，诱变率相对增加，而对供试材料产生的生物学损伤也随之变大，因此，在选择诱变浓度时，既要能达到比较丰富的变异，又不致于对材料损伤过大。另外，诱变处理的时间越长，EMS在材料中的渗透程度越高，造成的生理损伤程度也相应越强，而适宜的处理时间使受处理组织完全水合和被诱变剂浸透，因此，对种子进行诱变时，可预先浸泡，使种子内部的代谢和合成活跃起来，以缩短处理时间。

王允等[15]用5个EMS浓度（0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%）分别注入2份花生品系的龙骨瓣中，田间观察发现，2份品系畸变率随EMS浓度升高而增大。朱保葛等[10]用1个浓度（0.3%），3个处理时间（5，10，15 h）分别处理不同基因型的花生材料，结果发现，EMS诱导花生产生的突变频率因基因型和持续处理时间的不同而不同，各基因型对EMS处理的诱变反应不一致。殷冬梅等[12]、杨富军等[16]均设置多个诱变组合，以半致死量为选择条件，发现不同基因型品种对EMS的敏感性存在差异，筛选出各基因型品种的适宜诱变组合。

3 后代突变体的筛选鉴定方法

3.1 表型鉴定

诱变后代的突变体筛选是以诱变育种和基因功能研究为目的的，表型鉴定作为最常用的方法，要求必须有能遗传的、相对于野生型有显著差异的外观性状，其中也包括逆境筛选和化验分析筛选[17]。表型鉴定是基于作物的表型性状数据做出的分析鉴定。表型性状数据就是作物的形态特征数据，以花生为例，包括数量性状（主茎高、侧枝长、有效枝长、总分枝数、单株结果数等）和质量性状（叶型、叶色、株型、分枝型、花色、茎枝茸毛等）的数据。

表型性状是基因型、环境以及基因型与环境互作效应的综合表现，是可以直接观测的[18]。作物的一个表型可能由单个基因控制，也可能由多个基因控制，而作物的多个表型可能由多个基因控制，也可能由单个基因控制，由于表型和基因间的复杂关系，大多数的突变有多个突变表型。另外，数量性状受外部环境条件影响颇大，在突变体的筛选中，需要通过多代的田间观测鉴定来避免这一因素的影响[19]。

王传堂等[13]在田间观察2个花生诱变材料的后代，发现了果多果饱和表现特优的品系，从而获得了单株结果数、单株仁质量、饱果率比野生型明显提高的突变体。朱保葛等[10]在花生M2中统计出13种表型性状突变类型，对6个产量性状连续3 a进行了筛选对比和分析，得到了花生高产突变品系。

经过诱变的花生通过田间观察后代的表型性状，发现不同表型的突变体，经过筛选和鉴定，获得突出的目的性状，是诱变育种的理想结果，整个过程操作简便、成本低，但是费时费力，容易遗漏一些变异性状。

3.2 分子生物学鉴定

分子生物学方法是从分子水平来分析和比较DNA的碱基序列，挖掘突变体，确定突变频率，它可以在早期鉴定植株是否发生遗传变异，这种方法也称为DNA分子标记。分子标记用于鉴定突变体的优点在于突变位点以DNA形式表现，在植株的各个组织、各生育时期均可检测到，不受外部环境的干扰。目前，常用的分子标记检测方法有RELP，RAPD，SSR，AFLP，CAPS和基于单个核苷酸多态性的DNA标记等。殷冬梅等[12]使用随机扩增多态性DNA（RAPD）分子标记技术对不同的突变体进行了检测，找到了EMS诱变花生的突变位点，从分子水平上为突变的产生提供了有力的依据。房超琦[20]在分子水平上研究了高油酸突变体E-2-4-83-12的FAD2B基因编码区的碱基对发生了突变。

近年来，定向诱导基因组局部突变（targeting induced local lesions in genomes，TILLING）技术提供了从分子水平上定向规模化筛选突变体的技术平台，它是基于反向遗传学策略，将EMS诱变、PCR定向筛选和高通量检测方法相结合，它可以高通量、快速准确地筛选出由EMS诱变产生的单核苷酸多态性（SNPS,single nucleotide polymorphisms）和INDELS[21-22]。TILLING 技术的主要流程是：（1）EMS诱变种子，诱导产生一系列点突变；（2）单株种植M1；（3）产生 M2种子；（4）提取 M2单株的 DNA，存放于96孔微滴定板中，收获且保存M3种子，形成种子库；（5）构建DNA池；（6）设计特异性引物，PCR扩增大量的目标分析区域；（7）变性、退火，获得野生型和突变型发生错配的异源双链核酸分子；（8）酶切异源双链核酸分子，产物变性，进行凝胶电泳检测；（9）筛选突变子；（10）使用相同的方法在8倍库中找到突变单株[23]。目前，TILLING技术已广泛应用于小麦、玉米、大豆、水稻、大麦、拟南芥等20多种作物[24]，检测出大量目标基因变异位点，获得了多个不同类型的突变体，由此建立了相应的突变体库，为育种提供新的材料和种质。

目前EMS诱变花生产生的突变体后代，其筛选主要依靠表型鉴定，但存在EMS诱发产生的一系列点突变难以鉴定的问题，而TILLING技术实现了高频率点突变与PCR筛选技术的有效结合，这样既可以获得点突变的等位基因，又可在小范围突变群体内筛选到目标基因的突变体。虽然在EMS诱变花生的研究中尚没提到利用TILLING技术来规模化筛选突变体的报道，但是随着花生基因组序列的完成和公布，TILLING技术将很快被应用到其中。

4 应用前景

EMS诱变在作物育种中的应用已经非常广泛，育种家通过化学诱变的方法，随机改变遗传信息，利用正向遗传学原理，从表型数据入手，获得优异突变体，或者依据反向遗传学策略，检测出基因突变位点，建立相应的突变体库。无论哪种筛选方法，育种家总会获得一些优异突变体作为下一步选育或杂合的材料，最终选育出优异品种。我国拥有近7 000份的花生种质资源，包括栽培种和野生种，种质类型丰富，具备高油、高蛋白、高油酸以及抗逆、抗病等优异性状的种质材料很多，遗传多样性相对丰富[25]，但是，目前市场上大部分主推品种遗传血缘相近，如果利用化学诱变来改变花生种质的遗传信息，建立不同类型的突变体库，从中选择优异种质资源或中间材料，将为花生育种开辟一条更加广阔的天地。