微型月季花粉离体萌发培养基组分的优化

宋 杰 ，许 凤 ，张 露 ，李世峰 ，解玮佳 ，李树发 ，王继华 ，李绅崇

（1.云南省农业科学院花卉研究所，云南昆明 650205；2.云南省花卉育种重点实验室，云南昆明 650205；3.国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明 650205）

微型月季（Rosa hybrida var.Minima）是蔷薇科蔷薇属多年生灌木，其花、叶、枝、刺等形态特征都比一般的月季要小，而且花色丰富，花形美丽，株型秀丽可爱，是一种重要的园林观赏植物，被广泛用作园林地被和盆花[1-2]。微型月季具有广阔的市场前景，因此，其新品种的选育工作具有极其重要的价值。

然而，微型月季自交或杂交的结实率很低，通过杂交这一传统育种方法选育新品种是微型月季育种的难点。以往国内对于微型月季的研究主要集中在繁殖和栽培等方面[3-8]，对于其育种方面的研究也仅限于资源和品种分类[9]、亲本分析[10]、花粉形态[2]等，而关于微型月季花粉萌发和花粉管生长方面的研究则鲜见报道。

本研究以微型月季品种Unconditional Love（无条件的爱）为试验材料，检测和分析其花粉在不同培养基组分中的花粉萌发率和花粉管生长长度，并确定最适合其花粉萌发的培养基配方，旨在为微型月季的花粉活性检测和杂交育种的亲本选择提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试花粉的微型月季品种为Unconditional Love（无条件的爱），采自云南省农业科学院花卉研究所晋宁大春河基地内。2017年4月采集生长健壮的植株上饱满且未开放的花朵，在实验室内将其花药从雄蕊上剥下，置于培养皿中，将培养皿放置在干燥皿中干燥至花药破裂，用试管将散出的花粉进行收集，贮藏于-20℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配制 参考王岚岚等[11]的方法，以100 g/L 蔗糖，50 mg/L H3BO3，100 mg/L Ca （NO3）2·4H2O为培养基的基本组分。培养基各组分浓度梯度设置如表 1 所示。其中，蔗糖、H3BO3和 Ca（NO3）2·4H2O的浓度梯度以不加该物质为对照。

表1 培养基各组分浓度梯度

1.2.2 花粉的培养方法和培养时间的确定 采用液体培养法进行花粉培养。萌发试验均在花粉采集后24 h内进行。将收集的花粉充分混匀，用移液枪取制备好的培养液200 μL放入1 mL离心管内，加入适量花粉（约用牙签蘸2次），混合均匀后将离心管放入28℃恒温箱中暗培养4 h。

1.2.3 花粉萌发率和花粉管生长长度的测定 用移液枪取15 μL培养4 h后的花粉悬浮液于载玻片上，在带有摄像系统的光学显微镜（LEICA DM6000 B）下拍照记录。当花粉管生长的长度大于花粉粒的直径时，认为花粉萌发。通过统计萌发和未萌发的花粉粒数来计算花粉萌发率，花粉萌发率（%）＝萌发的花粉数/总花粉数×100%。采用显微镜自带的拍照系统测量每个视野中花粉管的长度，从而计算出花粉管生长的平均长度。

每个培养基组分的浓度梯度均设置3次重复，每个重复观测5个视野，每个视野内所统计的花粉粒数量大于50粒。

1.2.4 正交试验设计 在单因子试验的基础上，选择对微型月季花粉萌发影响较大的培养基组分，采用L25（56）正交试验设计，优化基本培养基组分的最佳组合。

1.3 数据处理

采用SPSS 18.0软件进行数据的统计分析，各处理间差异显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同培养基组分对花粉萌发和花粉管生长的影响

2.1.1 蔗糖 由图1可知，花粉萌发率随蔗糖浓度的增加先升高而后降低，当蔗糖浓度为100 g/L时，花粉萌发率达到最大值（5.23%），且与其他浓度处理间呈显著性差异。适合花粉管生长的最佳蔗糖浓度为100～250 g/L，此时花粉管的长度为516.07～546.90 μm，但差异不显著。

2.1.2 硼酸 由图2可知，当硼酸的添加量为0～125 g/L时，花粉萌发率随硼酸质量浓度的增加而升高，花粉萌发率在硼酸质量浓度为125 mg/L时达到峰值，为8.47%，之后随着硼酸质量浓度的增加而降低。花粉管生长的最佳硼酸浓度也为125 mg/L，此时花粉管长度为893.80 μm。

2.1.3 钙 从图3可以看出，微型月季Unconditional Love的花粉萌发率随着钙离子浓度的增加同样呈先升高而后降低的变化趋势，花粉萌发率的最高值为 16.34%，出现在 Ca（NO3）2·4H2O 质量浓度为150 mg/L时，而且此时花粉管生长的长度最长，为726.61 μm。

2.1.4 锌、镁、钾 由图4可知，花粉萌发率和花粉管长度随着锌、镁和钾的质量浓度增加均出现先升高再降低的现象。其中，当锌质量浓度为25mg/L时，花粉萌发率最大（13.04%），锌质量浓度为10 mg/L时，花粉管最长（491.62μm）；镁质量浓度为100mg/L时，花粉萌发率最大（16.95%），且花粉管最长（497.54 μm）；钾质量浓度为50mg/L时，花粉萌发率最大（5.02%），钾质量浓度为100 mg/L时，花粉管最长（447.52 μm）。

2.2 蔗糖、B和Ca三因子正交试验对花粉萌发和花粉管生长的影晌

通过单因子试验，确定蔗糖、硼酸和硝酸钙这3种组分对微型月季Unconditional love花粉萌发的影响较大。因此，进一步采用正交试验设计，筛选这3种组分最佳的组合（表2）。结果表明，在蔗糖150g/L＋H3BO3125mg/L＋Ca（NO3）2·4H2O100mg/L的处理组中，微型月季Unconditional love的花粉萌发率最高，为25.10%，且用该培养基培养时，花粉管生长长度为251.13 μm，仅次于蔗糖250 g/L＋H3BO375 mg/L＋Ca（NO3）2·4H2O 200 mg/L 的处理组，且生长良好，未出现异常。

对表2中的数据进行方差分析，得到的结果如表3所示。

从表3方差分析结果可以看出，蔗糖、H3BO3和Ca（NO3）2·4H2O对花粉萌发率的影响均达到显著水平，3个因子对花粉萌发率的影响从大到小依次为：蔗糖＞H3BO3＞Ca（NO3）2·4H2O；蔗糖和 H3BO3对花粉管生长长度的影响达到显著水平，且影响的显著性为 H3BO3＞蔗糖，Ca（NO3）2·4H2O对花粉管生长长度的影响未达到显著水平。方差分析的结果与直观分析的结果一致。

表2 正交试验中微型月季Unconditional love花粉的萌发率和花粉管长度

表3 方差分析结果

3 结论与讨论

花粉离体培养需要一定的糖、硼酸和钙，不同植物花粉萌发的适宜培养基不尽相同，它们的浓度大小很大程度上影响着花粉的萌发和花粉管的生长。糖类物质是花粉萌发及花粉管生长的重要营养成分，在花粉萌发过程中，能够为花粉提供能源、调节渗透压，同时，它还是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物质[12-14]。本试验结果表明，蔗糖对花粉的萌发影响显著。供试的微型月季花粉萌发率在一定蔗糖浓度范围内，先升高而后降低，在蔗糖质量浓度为150 g/L时，花粉萌发率最高，当蔗糖质量浓度大于200 g/L时，花粉萌发率开始下降，表明低浓度的蔗糖可促进花粉萌发，而高浓度的蔗糖可能会抑制花粉萌发，这与许多在其他园艺植物上的研究结果一致[15-16]。此外，一些针对大花香水类、丰花类和藤本类等月季的花粉萌发研究认为，150～200 g/L的蔗糖浓度为月季花粉最优的萌发条件[11，17-18]，而本研究认为，100～150 g/L的蔗糖浓度较适宜微型月季花粉的萌发，这可能是由微型月季花粉的渗透压比其他花型较大的月季低所致。

硼酸参与果胶物质的合成，有利于花粉管壁的建造[19]。植物缺硼的症状首先出现在快速生长的部位，如根尖和花粉管尖端，其特征一般为细胞壁异常[20]。花柱组织中存在的钙离子主要通过花粉管上的钙离子通道来调节花粉管内的动态变化，从而影响花粉管的生长[21]。一般情况下，植物花粉粒内所含的硼和钙是难以满足花粉萌发和花粉管生长需求的，自然状态下则由柱头和花柱内的硼和钙来弥补[22]。但花粉在离体培养时，花粉没有条件从柱头和花柱内获取硼和钙，要满足花粉的萌发和花粉管的正常生长，就必须在培养基中添加一定量的外源硼和钙。植物种类不同，其花粉萌发和花粉管生长所需的最适硼酸和钙离子的浓度也不同。本试验结果表明，微型月季花粉离体培养最适宜的硼酸质量浓度为 75～125 mg/L，这与 CHRYSOTHEMIS等[17]、王岚岚等[11]的研究结果一致；最适的钙质量浓度是100～150 mg/L，远高于 CHRYSOTHEMIS 等[17]研究得出的10 mg/L为最适浓度，这可能是由微型月季的特殊性所致。

镁在植物核酸和蛋白质代谢中起重要作用；钾在植物的糖类物质代谢、蛋白质代谢及呼吸作用中起重要作用，同时钾也是构成植物细胞渗透势的重要物质；锌是吲哚乙酸合成所必需的元素，进而对蛋白质的合成有促进作用。本试验结果表明，适宜浓度的镁、钾、锌对微型月季花粉的萌发均有促进作用，且其对微型月季花粉萌发促进作用的大小依次为镁、锌、钾。这与王岚岚等[11]的研究结果认为，镁和钾的浓度梯度变化对月季花粉萌发率无显著性差异的结果有出入。究其原因，应该是本试验是在含有蔗糖、硼酸和钙的基本培养基中再添加镁、钾和锌元素所致，也说明该3种矿质元素与蔗糖、硼酸和钙对促进花粉萌发起协同作用，而单独使用并没有效果。

本研究通过正交试验设计，确定微型月季花粉萌发最佳的基本培养基为蔗糖150 g/L＋H3BO3125 mg/L＋Ca（NO3）2·4H2O100 mg/L。培养基组分中蔗糖、硼酸对微型月季花粉萌发和花粉管的生长有显著影响，钙对花粉萌发和花粉管生长的影响弱于蔗糖和硼酸，其主要是通过协助蔗糖和硼酸而发挥作用，但这种作用也是微型月季花粉萌发所不可或缺的。

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