紫苏脂肪酸去饱和酶基因PfFAD2的生物信息学及表达特性分析

梁 倩，李 璐，安 茜，周雅莉，王计平

（山西农业大学农学院，山西太谷 030801）

紫苏（Perilla frutescens（L.）Britt.）是双子叶 1 年生草本植物，是国家卫生部第1批颁发的药食两用的中药植物之一，种子油富含α-亚麻酸[1-2]。目前，紫苏被认为是一种新型油料作物。

在植物油脂合成过程中，脂肪酸去饱和酶基因FAD2是定位于内质网上的Δ12油酸去饱和酶[3]，是产生多不饱和脂肪酸的关键酶基因，调控亚油酸和亚麻酸2种脂肪酸的合成，同时也用来调控植物细胞中大多数不饱和脂肪酸的合成，其催化产物及其衍生物对植物的生长发育具有重要作用。油酸是植物油脂中主要的单不饱和脂肪酸，在脂肪酸脱氢酶（FAD2）催化下形成亚油酸，而亚油酸是人体所必需的脂肪酸。研究表明，当儿童缺乏亚油酸时，会出现发育迟缓和湿疹皮炎等症状；当成人缺乏亚油酸时，会出现磷状皮屑、脱发和伤口难以愈合等症状[4-5]。FAD2是催化多不饱和脂肪酸生物合成的第1步反应[6]，在植物种子中，其表达量的多少决定着亚油酸含量的多少。所以，脂肪酸去饱和酶FAD2在不饱和脂肪酸的合成过程中发挥重要作用。

本研究对紫苏FAD2基因进行了详细的生物信息学分析，并分析了该基因在晋紫苏1号不同组织及不同发育时期种子中的表达特性，旨在为进一步阐明紫苏FAD2基因在脂肪酸合成代谢过程中的作用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

从紫苏转录组测序数据库中挑选出功能注释为FAD2的基因，根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守的特点，将紫苏中该基因序列与拟南芥FAD2同源序列进行比对分析，最后得到紫苏FAD2基因全长cDNA序列。

选取由中北大学张志军老师提供的晋紫苏1号作为试验材料，分析不同组织及不同发育时期的种子（开花后 10，20，30，40 d）中 PfFAD2 基因的表达特性。

1.2 试验方法

1.2.1 紫苏FAD2基因序列及蛋白功能分析 紫苏FAD2基因编码蛋白的理化性质通过ProtParam在线软件分析；亲疏水性、跨膜域利用ProtScale在线软件和TMHMM-2.0在线软件分析；功能结构域运用 NCBI的 CDD（Conserved Domiand Database）数据库进行分析鉴定；二级结构预测采用SOPMA在线软件分析；三级结构分析及建模采用Swiss-Model在线软件分析。系统进化树分析运用MEGA6.0多序列比对软件进行构建。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测 根据紫苏FAD2基因的cDNA序列设计荧光定量PCR特异引物，cDNA合成采用ABM公司试剂盒，实时荧光定量采用康润公司GenStar试剂盒。以紫苏18SrRNA作为内参基因[7]，进行荧光定量PCR检测。反应体系（10 μL）：2 ×RealStar Green Power Mixture 5 μL，RNase-free H2O 4.4 μL，上下游引物各 0.2 μL，模板cDNA 0.2 μL；反应条件为 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，40个循环。

2 结果与分析

2.1 PfFAD2基因全长cDNA序列及编码蛋白的理化性质分析

紫苏FAD2基因全长cDNA序列1 545 bp，ORF为1 149 bp，共编码382个氨基酸残基（图1），紫苏FAD2蛋白相对分子量为43.668 47 ku；分子式为C2033H3038N516O532S14，原子总数为6 133，脂溶系数为90.29，总平均亲水系数为-0.019，不稳定系数为36.58，属于稳定性蛋白。

利用ProtScale在线分析FAD2蛋白的亲疏水性，结果表明，FAD2蛋白在264位氨基酸残基处有最高值，是2.622；在369位氨基酸残基处有最低值，是-3.033，且以0为分界线，0以上代表疏水性氨基酸，0以下代表亲水性氨基酸。所以，FAD2蛋白是亲水性蛋白（图2）。

紫苏FAD2蛋白的跨膜结构表明，FAD2蛋白有6个典型的跨膜螺旋区，分别在52～69位、82～104位、114～136位、178～195位、222～239位、246～268位氨基酸（图 3）。

通过NCBI-CDD数据库对紫苏FAD2进行功能结构域分析，结果表明，FAD2蛋白含有PLN02505保守结构域，属于Membrane-FADS-like超蛋白家族（图 4）。

运用SOPMA对紫苏FAD2蛋白进行二级结构预测，结果表明，该蛋白的二级结构由α-螺旋（38.37%）、无规则卷曲（31.41%）、延伸链（23.04%）、β-转角（9.16%）4种结构元件组成。通过SWISS-MODEL在线软件对该蛋白三级结构进行预测，结果如图5所示。

利用MEGA 6.0多序列比对软件对紫苏（Perilla frutescens）及蓖麻（Ricinus communis）、油桐（Vernicia fordii）、芝麻（Sesamum indicum）、芡欧鼠尾草（Salvia hispanica）、红花（Carthamus tinctorius）等FAD2蛋白序列进行了比对分析，并构建了系统进化树，分析结果表明，紫苏与芡欧鼠尾草的亲缘关系较近，与红花的亲缘关系较远（图6）。

2.2 PfFAD2基因表达特性分析

为进一步了解FAD2基因在紫苏不同组织中的表达特性，本研究利用荧光定量PCR技术分析了该基因在晋紫苏1号不同组织及不同发育时期的种子中的相对表达量，结果如图7所示。FAD2在紫苏的不同组织器官中均有表达，并且在开花后20 d的种子中表达量最高，在其他组织中只是微量表达。

3 结论与讨论

脂肪酸去饱和酶FAD2（fatty acid desaturase 2）属于ω-6脂肪酸脱氢酶（ω6 fatty acid desaturase），是广泛存在于植物中的一种能催化油酸（oleic acid，C18∶1Δ9）脱氢生成亚油酸（linoleicacid，LA，C18∶2Δ9，12）的还原酶。亚油酸能有效降低血液中胆固醇含量[8]，是α-亚麻酸、花生四烯酸等重要多不饱和脂肪酸合成的前体，具有广泛的药用价值和营养价值[9-11]。PENG等[12]通过对油菜FAD2和FAE1基因的抑制表达研究，结果发现，油酸含量由15%提高到80%，多不饱和脂肪酸含量降至10%，而对人体有害的芥酸含量则降为0；TOPFER等[13]通过导入FAD2基因的反义基因，阻止FAD2基因表达，结果获得了油酸含量83%的转基因油菜。也有研究表明，过表达FAD2基因可以有效提高亚油酸的含量。崔琴琴[14]将FAD2基因导入粘红酵母中，结果表明，油桐FAD2基因的过表达能够调节酵母的亚油酸含量，转FAD2酵母亚油酸含量分别提高102.85%，81.95%，21.80%。赵娜等[15]在亚油酸缺失的拟南芥fad2突变体中导入文冠果FAD2基因，使得突变体中产生了亚油酸。

为进一步了解FAD2基因在紫苏脂肪酸合成机制中的调控作用，本试验对FAD2进行了较为详细的生物信息学分析，并研究了FAD2在晋紫苏1号的不同组织及不同发育时期的种子中的表达特性，结果表明，该基因cDNA全长序列为1 545 bp，共编码382个氨基酸残基，紫苏FAD2蛋白含有PLN02505保守结构域，属于Membrane-FADS-like超蛋白家族。系统进化树分析结果表明，紫苏与芡欧鼠尾草的亲缘关系较近，与红花的亲缘关系较远。周菲等[16]研究了脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1在向日葵种子中的表达特异性，结果显示，该基因在12～22 d的时候表达量达到高峰。本研究分析结果表明，紫苏FAD2基因在开花后20 d的种子中高效表达，这与周菲等[16]的研究结果相似。

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