芜湖地区饮用水中四环素类抗生素含量检测分析

丁苗苗，金 晨，胡春媛，于 荣，刘 飞，文育锋

(皖南医学院 1.公共卫生学院;2.检验学院，安徽 芜湖 241002)

用于人类和动物的抗生素30%～90%可以通过尿液和粪便排泄到水环境中，且大部分未代谢，常规废水和再循环水处理只能部分去除或降解，抗生素残留已被公认为对健康有影响的新一类环境污染物[1]。当前我国关于水环境中抗生素的残留分析主要集中在海水、河水和城市污水，对饮用水中抗生素的污染调查及评估非常缺乏，饮用水中抗生素长期低剂量暴露，可加剧致病微生物耐药性的发展[2-4]，来自食物或饮用水中的抗生素暴露与儿童肥胖风险增加有关[5]，因此，开展饮用水中抗生素残留检测与评估的研究具有现实意义。

我国四环素类抗生素的使用占整个抗生素市场份额的15.8%，其在环境中降解后吸附力强，可长期稳定地存在于水环境中[6-7]，极易通过饮用水进入人体从而影响健康。研究显示在河流、湖泊、地下水中均检测到四环素类抗生素的残留[8-9]。在安徽地区，仅有王莹[10]针对饮用水源及污水开展过抗生素污染相关研究，为评估芜湖地区的饮用水抗生素残留现状，本研究以四环素类抗生素为目标检测物，对芜湖地区饮用水中四环素类抗生素进行检测分析。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪带紫外检测器(U3000型，Thermo Fisher Scientific公司，美国)；12位固相萃取装置(57044型，Sepelco公司，美国)；12位手动氮吹仪(HGC-12A型，天津恒奥科技发展有限公司，中国)；Sepelco HLB固相萃取小柱(200 mg/6 mL)；超纯水发生器。

1.1.2 试剂 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素4种标准品均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，甲醇、乙腈、乙酸乙酯为色谱纯，草酸与浓盐酸为分析纯。

1.2 标准溶液及溶液配制 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素4种标准品用甲醇配置成质量浓度为1 g/L的储备液，在-18℃下避光保存；混合标准工作液现用现配，准确吸取适量的标准储备液于棕色容量瓶中，用超纯水稀释成所需的浓度。

1.3 样本采集 在芜湖市弋江区、镜湖区、鸠江区、三山区、南陵县、繁昌县、芜湖县七个地区的居民家中采集自来水水样，置于棕色瓶中保存，48 h内上机测定。

1.4 样品前处理 取1000 mL的末梢水，加入浓盐酸调节pH至2左右，以12 mL/min左右的流速通过Sepelco HLB固相萃取小柱，HLB小柱在使用前预先依次用10 mL甲醇和10 mL超纯水活化，活化时要保持萃取小柱浸在溶液中，水样萃取结束后负压抽干小柱5 min，再用10 mL含10%甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱并收集，置于氮吹仪上氮气吹干，以30%的甲醇溶液定容至2 mL,样品经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。

1.5 液相色谱条件 Thermo Fisher C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温：40℃；流动相A为甲醇，B为乙腈，C为0.01 mol/L草酸；流速为1 mL/min；进样量为20 μL；检测波长为365 nm。见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

时间/min流速/(mL/min)甲醇/%乙腈/%0．01mol/L草酸/%01149531102070815455010．515455011114952011495

2 结果

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择 参照GB/T 20764-2006《可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法》，流动相采用甲醇+乙腈+0.01 mol/L草酸(2+1+7)，4种药物能得到有效分离，但峰型欠佳，保留时间较长，怀疑是未进行梯度洗脱的原因。故根据贺蕴普等已发表的文献[11]，流动相参照其体系①方法：甲醇+乙腈+0.01 mol/L草酸，同时采用梯度洗脱的方式，色谱峰之间分离良好，四个目标峰峰型尖锐；参照其体系②方法：甲醇+乙腈+0.01 mol/L三氯乙酸，4种药物分离效果良好，峰型尖锐，但出峰时间相对延长；参照其体系③方法：甲醇+乙腈+0.01 mol/L草酸+0.01 mol/L三氯乙酸，在①的基础上添加20%的三氯乙酸，并未出现原文中4种药物的洗脱速度提升现象，反而出峰速度变慢且保留时间相对的延长。因此本研究参照贺蕴普体系①方法，选择甲醇+乙腈+0.01 mol/L草酸为流动相，并进行梯度洗脱。

2.1.2 色谱图结果 图1为4种四环素类抗生素的标准液相色谱图，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的保留时间分别为6.905、7.255、8.550、9.005 min,可见四种药物分离效果良好，能在10 min内完全洗脱，峰型尖锐。见图1。

图1 4种四环素类抗生素标准品的液相色谱图

2.2 线性范围及方法检出限 配制浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、10 mg/L的混合标准工作液，每个浓度均取20 μL进行HPLC检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，计算其线性范围、线性方程与相关系数。在空白样品中加标液并稀释，取信噪比为3时所对应的浓度为方法检出限。见表2。

表2 4种四环素类抗生素的工作曲线

抗生素线性方程相关系数方法检出限/(μg/L)土霉素y=0．6674x-0．00720．99980．0689四环素y=0．7416x+0．01060．99970．0272金霉素y=0．5070x-0．04890．99940．2241强力霉素y=0．4460x-0．00140．99990．0512

2.3 回收率与精密度 准确吸取适量的混合标准溶液添加到空白末梢水中，配制成浓度为0.1 mg/L和1 mg/L的加标水样，每个水平取7个平行进样，做加标回收率实验，同时计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，结果见表3。由表3可知，4种四环素类抗生素的平均回收率为81.82%～151.11%，精密度良好。

表3 方法的回收率和精密度(n=7)

抗生素加标浓度/(mg/L)实测值/(mg/L)回收率/%RSD/%土霉素0．10．0863586．357．4210．8766087．661．10四环素0．10．0839583．954．6810．8471884．720．73金霉素0．10．15111151．114．8710．8121481．217．04强力霉素0．10．0854685．468．4010．9201792．022．64

2.4 实际样品测定 用上述分析方法对21份芜湖市居民家中的末梢水进行测定，结果水样中四环素组分的浓度均低于检出限，均未检出4种抗生素。

3 讨论

针对环境水体中四环素类抗生素的检测方法主要有：高效液相色谱与紫外联用(HPLC-UV)、液相色谱与质谱联用(LC-MS)、高效液相色谱与串联质谱联用(HPLC-MS/MS)及超高效液相色谱串联质谱联用(UPLC-MS/MS)等[12]。高效液相色谱(HPLC)是检测四环素类药物的首选方法[13]，本研究采用的是HPLC-UV法，相对于高效液相色谱与质谱(HPLC-MS)联用或串联质谱(HPLC-MS/MS)联用法灵敏度较低，检出限较高，但成本低廉，更适合常规实验室或一般检测分析使用。本研究建立的方法选择Sepelco HLB小柱萃取四环素类抗生素，该柱的萃取效率较高(﹥80%)，保证了此研究方法有较好的重现性。四环素类抗生素通常以盐酸盐形式存在，在酸性溶液中较稳定，故本研究中用浓盐酸将水样pH调节至2左右，流动相中采用浓度为0.01 mo/L的草酸，提高目标物的稳定性。

本研究在检测饮用水中的四环素类抗生素时仅采用定性方法，确定了检出限，并未进一步探究定量限，故在检出四环素类抗生素的前提下，不能够更进一步明确其具体残留量。此外，研究中饮用水的采集地为芜湖，芜湖处在长江南岸，青弋江与长江汇合处，河湖水网密布，雨量充沛，水系发达，也有可能是抗生素残留浓度低未检测出的原因，而赵腾辉等检测东江上游水体四环素浓度达32.24 ng/L[14]。由于多数抗生素在环境中的浓度与有机物污染有关联，同时也受水体的自净能力和其他污染物等环境因素的制约和影响，因此在进一步探索抗生素残留检测方法、开展抗生素残留对健康危害的研究的同时，环境因素的分析也是必要的。

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