猪细小病毒VP2重组蛋白的诱导表达及表达产物的纯化

孙 超，高 莹，丁 晨，佟 洋，范 慧，张宏玲

（吉林农业科技学院动物科技学院 132101）

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)属于细小病毒科细小病毒属，是一种自主复制型病毒，临床常以妊娠母猪流产、死胎、畸形胎、胎儿木乃伊化及弱仔等一系列症状为特征。猪细小病毒病常与其他导致母猪繁殖障碍的病原混合感染而致病，给养猪业带来了严重的损失[1-2]。目前国内外针对猪细小病毒病的诊断有很多方法，其中以全病毒为检测抗原的免疫学方法较常用,但由于全病毒在检测应用过程中有很强的感染性，且其生产和纯化技术要求较高。因此应用重组蛋白来检测猪细小病毒病显得尤为重要。鉴于此，本研究利用表达载体pET-SUMO在大肠杆菌中对VP2重组蛋白表达，并经过滤膜、饱和硫酸铵、树脂层析进行一系列的纯化获得高纯度的重组蛋白，为新型诊断试剂盒的研制提供基本资料。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒

pET-sVP2重组质粒为本实验室构建；大肠杆菌表达载体pET-SUMO、宿主菌BL21均购自北京原平皓生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

限制性内切酶NcoI和HindⅢ购自南京生物制品有限公司；蛋白质分子质量标准购自南京生物制品有限公司；T4DNA连接酶购自Promega公司。质粒提取纯化试剂盒购自Omega公司。DNA片段纯化回收试剂盒购自Axygen公司。

1.3 重组蛋白的表达、可溶性分析

采用不同 IPTG 浓度（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L）、不同时间（0，1，2，3，4，5，6，7h）、不同温度(25，27，29，31，33，35，37℃)对pET-sVP2重组蛋白进行诱导表达。经SDS-PAGE分析，确定重组蛋白的最佳条件诱导表达后，冰浴超声裂解表达菌，于4℃离心机13000 r/min离心10min，收集上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，鉴定其可溶性，为下一步蛋白的纯化提供依据。

1.4 重组蛋白的纯化

将经SDS-PAGE电泳鉴定后的以包涵体形式表达的重组蛋白洗涤后，于－80℃冰箱反复冻融3次后进行超声裂解；离心，收集上清液，用0.45μm滤器过滤除去大分子杂质。收集滤液分段加入硫酸铵，4℃搅拌过夜析出沉淀，然后离心6min，沉淀重悬于PBS中，透析、除盐。将经硫酸铵纯化后的重组蛋白上Ni-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化。用透析袋对纯化后的蛋白进行复性，用紫外分光光度法测定蛋白浓度。

2 结果

2.1 表达产物的SDS-PAGE

经诱导表达的重组蛋白进行SDS-PAGE，可见一明显52ku的目的条带，与预期结果一致（见图 1）。将重组菌体进行超声破碎，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果显示，重组蛋白在上清中含量较少，主要以包涵体的形式进行表达（见图 1）。

图1 重组蛋白的SDS-PAGE分析

2.2 表达产物纯化后的SDS-PAGE

取纯化的蛋白样品沸水浴5min，取20μL进行SDS-PAGE，结果显示经过滤膜、饱和硫酸铵纯化后除掉了大量的杂蛋白，经过Ni-NTA柱纯化后在52ku处仅有一清晰的特异性条带（见图2）。证明纯化效果良好。紫外分光光度法测定蛋白浓度为2.29mg/mL。

图2 重组蛋白的纯化

3 讨论

目前，国内外针对猪细小病毒病的诊断有很多方法，其中以全病毒为检测抗原的免疫学方法较为常用,但由于全病毒在检测应用过程中有很强的感染性，且其生产和纯化技术要求较高。因此应用重组蛋白作为抗原来检测猪细小病毒病显得尤为重要[3-4]。在大肠杆菌表达系统中，pET系统是蛋白表达的首选。在IPTG存在的条件下，该系统可调动几乎所有细胞资源都用于目的基因表达[5]。故本研究选择大肠杆菌表达载体pET-SUMO，使得重组蛋白得以高效表达。常用的纯化方法有中性盐沉淀法、低温乙醇沉淀法、凝胶柱层析法、免疫亲和层析、高效液相色谱法等[6]。本研究通过对纯化流程的优化，对融合蛋白进行纯化并去除了杂蛋白，电泳结果可以看出，几乎清除所有的杂蛋白而只保留了目的蛋白，试验证明大大提高了融合蛋白的纯度。旨在为猪细小病毒病诊断方法的建立提供大量高纯度的重组VP2蛋白；同时，也为实现重组VP2蛋白的规模化生产提供参考数据。