大白菜小孢子培养中的污染问题及防治对策*

王秀英 兰创业 赵军良 李改珍

（山西省农业科学院蔬菜研究所，山西 太原 030031）

组培过程中，培养基和培养材料受外界真菌、细菌或培养材料的内生菌侵染滋生杂菌，导致组培失败，称为组培污染[1]。从污染产生的病原来看主要有真菌和细菌两类[2]，操作不当、外植体消毒不充分、培养基及工具消毒不过关、无菌操作室消毒时间过短、无菌操作程序不严格等都会造成污染[3]。各种因素引起的组培污染一直最大程度地制约着组培技术的发展[4]。

我们在大白菜游离小孢子培养过程中发现，花蕾的选择、清洗、消毒、研磨、离心、分装、培养等环节的操作都要严格按照操作规程，否则极易造成污染。目前，国内报道较多的影响大白菜游离小孢子胚诱导率的因素有基因型[5～10]、小孢子发育时期[11～12]、培养方式[13]、供体植株生长环境条件[5，14～15]等，影响胚诱导再生植株的因素有胚的类型、培养基水分状况、活性炭[16～17]等，而对培养过程中存在的污染问题及防治措施报道较少。

大白菜的开花期有1个月左右，始花期后期和盛花期前期是小孢子培养取材的最佳时期，适宜取材接种的时间很短，只有10 d左右，培养过程中应尽量避免污染导致培养失败。多年来我们一直从事大白菜小孢子培养工作，在培养过程中的污染问题及防控措施方面积累了一些经验，现将其介绍如下。

1 污染问题

1.1 细菌性污染

培养过程中肉眼观察到培养基呈黏稠状或显微镜观察到细胞已团集而不再均匀分散，是细菌性污染的主要症状，一般在接种后1～3 d即可发现是否发生细菌性污染。细菌性污染一般由接种工具、培养基、洗液、无菌水、花蕾等消毒不彻底，操作不规范造成的。

1.2 真菌性污染

真菌性污染常发生在培养后期，培养基上出现黑、绿、红、黄、白不同颜色，不同大小的菌斑是发生真菌性污染的症状。真菌性污染发生的主要原因有存放培养基的环境中真菌孢子浓度过大、培养基瓶口密封不严、接种材料多、接种时间长、超净工作台滤网不干净、空气中有真菌孢子漂浮等。真菌性污染的发生症状会随着培养时间的延长而表现出来。

2 防治对策

游离小孢子培养接种前要认真挑选材料、严格灭菌，接种时规范操作，接种后调控培养环境，严防病原菌侵入，将污染率降到最低。

2.1 接种前

2.1.1 试验材料的选择

选择无虫眼、无裂缝、表面光滑的花蕾和清澈透明的培养基作为试验材料，避免消毒不彻底而造成污染。

2.1.2 培养基灭菌

花粉培养用的NLN液体培养基主要通过过滤除菌，一般需过滤2～3次，过滤每L培养基需耗时10多h，将过滤后的培养基分装于不同的三角瓶中，在常温下观察1周多。如果污染严重，第2 d培养基就会出现浑浊；如果污染轻微，第2 d、第3 d培养基仍然透明，但随着时间的延长会看到白色棉絮状漂浮物由小变大。液体培养基除菌过程中的过滤器及相关器皿都要严格消毒，并在超净工作台上进行过滤。

2.1.3 B5洗液、无菌水、接种工具等高压蒸汽灭菌

灭菌前设定温度和时间，冷空气要排放干净，避免压力表上的温度和压力指标与锅内实际温度和压力不符而导致灭菌不彻底；液体最多占容器体积的2/3，避免液体冲破封口膜造成污染；固体器皿包裹后均匀摆放在锅内，切不可拥挤堆放使蒸汽流通和热交换受阻，导致灭菌不彻底；灭菌结束后，待指针归零时才能取出消毒物品，切忌打开放气阀急速放气，降温太快会导致灭菌不彻底。根据灭菌对象不同，灭菌时间长短也不同。洗液、无菌水等液体，灭菌时间为30 min左右，需冷却后使用；烧杯、试管、玻璃棒、离心管、吸管、镊子、培养皿等器皿，灭菌时间为20 min左右，灭菌后将器皿放入烘箱烘干备用。

2.2 接种过程中

2.2.1 接种室和超净工作台的灭菌

保持接种室清洁，定期打开紫外灯杀菌，接种前喷洒75%酒精降尘；接种前打开超净工作台的紫外灯杀菌20～30 min，提前20 min打开鼓风机，保证超净工作台内部气流畅通，勤洗过滤网，使空气洁净无杂菌；接种前对台面、试管架、酒精瓶及工具进行彻底消毒。接种时用75%酒精擦拭双手，点燃酒精灯，拉下挡风玻璃，仅够接种人员伸入双手操作即可。

2.2.2 材料表面的消毒

挑选好的花蕾先用自来水冲洗干净，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡约30 s后迅速浸入0.1%升汞溶液中消毒5～10 min[18]，或用7%次氯酸钠消毒15 min。材料消毒后用无菌水冲洗3次，每次5 min。

2.2.3 研磨和过滤

将镊子和玻璃棒蘸上酒精在酒精灯外焰上充分灼烧，冷却后备用；将离心管和滤斗用镊子夹夹在一起放到试管架上。整个操作过程忌互相碰撞，接触部位需在酒精灯上灼烧消毒。将消毒后的花蕾放入试管内，倒入一定量的洗液，用玻璃棒轻轻挤压，使其散出花粉，将滤液过滤至离心管，盖紧盖子并用封口膜封好管口再离心。

2.2.4 离心和分装

离心2～3次，每次离心后都要在超净工作台上用75%医用酒精擦拭双手和离心管外壁。离心后弃上清液，倒入适量培养基，悬浮后分装于培养皿内。分装时管口要在酒精灯上灭菌，吸取添加物前对吸管口也要灭菌。分装后，用封口膜把培养皿封严，阻断内外空气对流，避免污染。

2.3 接种后

保持培养箱清洁，用75%医用酒精擦拭内壁，设定好温度和湿度。注意湿度的设定，湿度大了易造成污染，湿度小了空气干燥，封口膜易裂开造成污染。

3 其它防治对策

NLN培养基中应加入一定浓度的抗生素或杀菌剂，以防内生菌污染，NLN培养基常温下过滤除菌后，不会造成抗生素或杀菌剂的分解，但要通过试验筛选出抗生素或杀菌剂的最佳使用浓度。控制污染、建立洁净培养环境、无菌的植株系统是组培育苗成功的三要素[19]。