口含烟对人口腔致病菌的影响

高茜，管莹，米其利，黄海涛，杨继，徐玉琼，简小朋，夭建华

1 云南中烟工业有限责任公司，云南 昆明 650106；

2 上海新型烟草制品研究院有限公司，上海 200082

近年来，我国人民的口腔健康状况发生了明显的改变，相关疾病患病率向青中年偏移，其中变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌是龋病和牙周病变的主要致病菌[1-4]。烟气颗粒物能够改变口腔内微环境，对口腔内定居微生物会产生影响。

口含烟是新型烟草制品，不产生烟气，又能满足摄入尼古丁的需求，是传统卷烟的一种重要补充形式[5]。口含烟被报道与口腔白斑病变、口腔癌等疾病有关[6]，其生物学活性和安全性受到极大关注。然而，国内外目前在口含烟对于口腔微生物菌群的影响尚无定论[7-9]，本文采用体外细菌培养及口腔唾液检测两种方法，选用了3种不同吸食方式的口含烟，对口腔总细菌、变形链球菌及牙龈卟啉单胞菌的影响进行研究，并与传统卷烟烟气相比较。

1 材料与方法

1.1 研究样品

General牌袋装口含烟（White Mini口味，每袋重量约0.8 g，烟碱含量0.8%，G-M），Nicorette胶基口含烟（原味，每颗重量约1.2 g，烟碱含量2 mg，N-2），云南中烟开发含片型口含烟（酸角味，每颗重量约0.6 g，烟碱含量0.5 mg，S-0.5），玉溪牌卷烟（硬，焦油量11 mg，YX）。

1.2 研究对象

国际标准菌株ATCC25175（变形链球菌）和GIM1.387(牙龈卟啉单胞菌)购自广东微生物菌种保藏中心。

随机选择志愿参加口腔试验的志愿者，入选标准为：(1) 口腔健康，牙齿完整，咬合关系正常；(2) 无未经治疗的龋坏，龋失补牙面数不大于4，无正畸矫治器，无口腔软组织疾病，无牙髓及根尖周病变；(3)无全身系统性疾病，无长期服药史，未曾使用含氟牙膏及漱口水，实验前2周和实验期间未服用抗生素类药物及影响唾液分泌的药物。实验前 2 h禁食、禁刷牙、漱口和吸烟。所有受试者均签署知情同意书。

1.3 试剂和仪器

轻唾杆菌肽琼脂培养基（Difco公司）；脑心浸液培养基、变形链球菌培养基（Oxoid公司）；冻干脱纤维羊血（研拓公司）；氯化钾血红素、维生素K1、亚碲酸钾（卡迈舒公司）；L-半胱氨酸、杆菌肽（百灵威公司）；PBS磷酸缓冲液（GIBCO公司）；0.45 μm一次性过滤器（Millpore公司）；培养皿、离心管（Coning公司）。

参照文献设计变形链球菌引物及探针[10]、细菌通用引物及探针[10]、牙龈卟啉单胞菌引物及探针[11]（Invitrogen公司）；实时荧光定量PCR试剂盒（KAPA™ Probe公司），微生物裂解液（Takara公司）；荧光定量PCR 96孔板、荧光定量PCR96孔板膜（Biotipsci公司）；无水乙醇（西陇化工公司）。

二级生物安全柜（HFsafe-1500）；高压蒸汽灭菌锅（ALP CL-40M）；厌氧培养箱（BACTRON 1-2）；电子天平（梅特勒XS204）。

1.4 实验方法

1.4.1 烟草制品的前处理

袋装型口含烟：取袋装口含烟制品1袋，去掉包装后加入10 mL pH7.2的磷酸缓冲液于37 ℃下恒温震荡24 h（150 rpm）进行萃取，然后8000转离心10 min，取上请液在生物安全柜中用0.45 μm一次性过滤器过滤除菌，将待测液用无菌冻存管分装在1 mL无菌管中冻存，测定烟碱含量后-20 ℃保存待用。

胶基型口含烟：取胶基型口含烟1粒，用剪刀剪成2 mm3小块后加入研钵中，量取10 mL pH7.2的磷酸缓冲液，加入4～5 mL在研钵中，加热至37 ℃浸泡30 min，再研磨10 min，将溶液移入15 mL离心管中，将剩下溶液倒入研钵中继续研磨10 min，然后移入离心管中，用0.45 μm一次性过滤器过滤后，分装在1 mL无菌离心管中，测定烟碱含量后-20 ℃保存待用。

含片型口含烟：取含片型口含烟1粒，放入15 mL离心管中，加入10 mL pH7.2的磷酸缓冲液，室温放置1 h，待完全溶解后，在生物安全柜中用0.45 μm一次性过滤器过滤后，分装在1 mL无菌离心管中，测定烟碱含量后-20 ℃保存待用。

传统卷烟：参照YQ 2—2011《烟草及烟草制品烟气安全性生物学评价 第1部分：中性红细胞毒性法》附录A标准方法进行烟气捕集[12]。将卷烟在恒温恒湿箱中平衡48 h，选取重量和吸阻一致的烟支。按上述标准方法，分别在全自动转盘式吸烟机上抽吸20支卷烟，用剑桥滤片捕集器中剑桥滤片捕集烟气的总粒相物。剑桥滤片用二甲基亚砜（DMSO）浸泡，超声波提取20 min，最后定容至 10 mg TPM/mL DMSO[12]，采用液相色谱法测定TPM中的烟碱含量[13]，-80 ℃低温保存备用。

1.4.2 体外细菌培养实验

取冻干粉状贮存的国际标准菌株ATCC25175（变形链球菌）和GIM1.387(牙龈卟啉单胞菌)，常规方法接种于100 μL无菌生理盐水中活化3 h，将复苏的菌种分别涂布于变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌固体培养基上，37 ℃厌氧培养48 h。挑取牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌单个菌落混悬于无菌水中，稀释至OD600 在0.6-0.8之间，备用。

将上述冻存的烟草制品提取液取出，室温解冻，使用磷酸盐缓冲液将样品稀释至50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL 3个浓度。按1∶1的比例将待测样品与细菌混合，每个浓度总量1 mL, 厌氧条件下37 ℃共培养6 h，然后取50 μL涂在对应的培养板上，放置于厌氧培养箱内37 ℃培养48 h，进行计数。

1.4.3 志愿者口腔内细菌检测

1.4.3.1 唾液样本采集

受试者唾液采集时间集中安排在每周二上午9∶00～11∶00，采集唾液在安静的房间里进行，受试者采用坐位，实验前2 h禁食、禁刷牙、漱口和吸烟。

参考文献报道方法进行唾液采集[14]，静态唾液进行2次时间段的采集，以吸食口含烟的时间点为0点，静态唾液的采集时间段为-5～0、90～95 min。动态唾液进行4次时间段的采集，采集唾液的时间段为 0～2、2～5、5～10、10～15 min，持续使用时间共 15 min。在动态唾液收集完后受试者可正常走动，但禁刷牙、漱口和吸烟。所采集的唾液放于-20 ℃冰箱冻藏保存。经一周间隔期做重复性试验，共重复3次，收集方法一致。

1.4.3.2 唾液样本DNA提取

取各个志愿者的唾液0.5 mL置于无菌1.5 mL EP管中，将EP管中唾液进行4 ℃离心10 min（12000 r/min），去除上清液，再加入50 μL微生物PCR专用裂解缓冲液于EP管中，混合均匀，然后置于80℃水浴锅中热变性15 min，低速离心1 min（1000 r/min），最后取上清液与无菌水按1∶8比例稀释后作为荧光定量PCR的模板。

1.4.3.3 标准曲线绘制及实时荧光定量PCR检测

采用国际标准菌株提取DNA作为阳性标准品，总细菌标准品使用的是多种口腔细菌标准株DNA混合液（牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等）。测定阳性标准品的原始 DNA稀释液在波长260 nm、280 nm的光密度值 ( optical density，OD)，OD260与 OD 280比值大于 1.8，表明纯度合格。用OD260测定值和片段长度数据换算出阳性标准品原始DNA稀释液的浓度（细菌数／μL）。阳性标准品梯度制备：取阳性标准品的原始DNA稀释液 5 μL加水45 μL并充分混匀 10倍稀释后，再根据实验需要依次10倍稀释，建立定量标准曲线。阴性质控标准品采用灭菌双蒸水。

反应体系（20 μL）：2×SYBR mix 10 μL、上下游引物（序列见表1）各200 nmol/L、探针250 nmol/L、无菌水1.475 μL、模板（上清液）8 μL且混合均匀。反应条件为：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 15 s，退火／延伸 60 ℃ 1 min， 进行45个循环。每个样本检测均重复3次，取其平均值。每次反应均设空白对照和标准品阳性对照。

表1 荧光定量PCR所用的引物及探针Tab.1 Fluorescent quantitative PCR primers and probes

1.4.4 统计学分析

实验结果以均数±标准差表示，使用PrismGraphPad 6.0软件进行绘图及统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 不同类型的口含烟对体外细菌的影响

表2为3种口含烟提取液及传统卷烟TPM对2种体外培养细菌生长的影响结果。可以看出，TPM对2种细菌均有明显抑制作用，而3种口含烟提取液中，除G-W在高浓度时对牙龈卟啉单胞菌的抑制作用明显外，其他均无显著影响。

2.2 不同类型口含烟对唾液中细菌总量的影响

图1A为唾液总细菌的荧光定量PCR标准曲线，图1B为吸食口含烟及传统卷烟后唾液中细菌量的动态变化。由图1B可见，唾液中总细菌数目在吸食袋装型、含片型口含烟及传统卷烟后2 min内降低明显，在吸食的2-15 min逐步上升回复，在吸食结束休息1h之后已经回复至吸食前水平；而在吸食胶基型口含烟后显著增高，在2-5 min时间段达到高峰，随后的5-15 min逐渐下降，在停止吸食后逐步恢复至吸食前水平。

图2A为变形链球菌的荧光定量PCR标准曲线，图2B为吸食口含烟及传统卷烟后唾液中变形链球菌数量的动态变化。由图2B可见，变形链球菌数量在吸食胶基型口含烟后明显升高，在整个咀嚼过程（0-15 min）中变形链球菌的含量都远远高于吸食前水平，直到休息1 h之后才逐渐回复；吸食含片型口含烟和传统卷烟的2 min内唾液中变形链球菌含量稍有降低，但在吸食10 min后均回复到吸食前水平；吸食袋装型口含烟在吸食2 min内稍有升高，随后也在吸食10 min后回复到吸食前水平。

表2 口含烟和传统卷烟TPM的体外抑菌试验Tab.2 In vitro anti-bacterial test of SLT and traditional cigarette TPM

图1 吸食烟草制品前后人唾液中细菌总量的动态变化Fig.1 Dynamic changes of total bacteria in human saliva before and after taking tobacco products

图2 吸食烟草制品前后人唾液中变形链球菌数的动态变化Fig.2 Dynamic changes of Streptococcus mutans in human saliva before and after taking tobacco products

图3 A为牙龈卟啉单胞菌的荧光定量PCR标准曲线，图3B为吸食口含烟及传统卷烟后唾液中牙龈卟啉单胞菌数量的动态变化。由图3B可见，牙龈卟啉单胞菌数在吸食袋装型和胶基型口含烟后都明显升高，且一直持续到吸食5 min后才开始回复，吸食15 min后仍稍高于吸食前水平，一直到吸食后休息1 h才回复到吸食前水平；吸食含片型口含烟和传统卷烟的2 min内唾液中牙龈卟啉单胞菌数含量都稍有降低，在2-15 min时段均有所波动，但一致的是在吸食休息1 h后均回复到吸食前水平。

图3 吸食烟草制品前后人唾液中牙龈卟啉单胞菌数的动态变化Fig.3 Dynamic changes of Porphyromonas gingivalis in human saliva before and after taking tobacco products

3 讨论

吸烟被认为是很多系统疾病的患病风险因素，可能引起牙周炎、白斑等多种口腔疾病，因此，烟草与口腔健康越来越受到关注[15]。口腔富含营养，受到诸多微生物群的影响，吸烟与口腔微生物的研究报道也越来越多，对于口含烟的相关研究较为少见，且研究结果不尽一致，其原因可能是烟草类型和微生物种群不同[16-18]。本研究从体内和体外两个方面研究了3种不同类型口含烟对人口腔总细菌及致病微生物的影响。由于不同类型的口含烟吸食方式差异较大，比如袋装型采用上唇和牙龈之间含用，胶基型采用咀嚼方式，含片型直接采用舌上含服，因此这三类产品的前处理方式大有不同。但是无论哪种类型的制品，最重要的目的都是通过烟碱来让消费者达到满足感，烟碱含量是衡量不同类型制品间的有效桥梁，因此本文设置了在同样烟碱浓度下测试不同提取物抑菌的效果。

本研究所涉及的两种细菌与口腔疾病的关系比较明确。其中患龋情况和唾液变形链球菌数量具有明显相关性。研究人员发现唾液中有龋和无龋组中变形链球菌水平具有显著的统计学差异，而吸烟人群患龋率较非吸烟人群明显降低[19]。Tandon等人的研究显示无烟气烟草具有微弱的变形链球菌的抗性，而传统烟草抑制效果更为显著[20]。本研究结果与其基本一致，但略有不同的是在吸食袋装型和胶基型口含烟时，唾液中的变形链球菌含量有所增高。变形链球菌在口腔中的存在方式是吸附在牙齿上，形成所谓的“生物膜”，袋装型口含烟的吸食方式为贴附于牙龈和嘴唇之间，胶基型为咀嚼运动，这两种动作都有可能引起变形链球菌的脱落而导致唾液中含量升高。在吸食以上四种烟草制品一段时间之后，唾液中的变形链球菌含量回复至吸食前水平，这与细菌总量的结果是一致的。此外，Keen和Johnson报道了无烟气烟草吸食者唾液中尼古丁含量对变形链球菌具有剂量依赖的促进作用，可能会让吸食者面临龋齿风险[21]。但众所周知，一些无烟烟草含有甜味剂，其可能是增加变形链球菌体外生长的因素。

牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要致病菌，即使是少量的牙龈卟啉单胞菌也能造成严重的牙周炎。已有的研究显示，吸烟者牙龈卟啉单胞菌的感染率高于非吸烟者，但二者差异无显著意义[22]。而Eggert等的研究发现吸烟者龈下菌斑中总细菌数增加，其中牙龈卟啉单胞菌的检出率明显高于非吸烟者[23]。另一些研究认为吸烟者与非吸烟者龈下牙周致病菌无差异[24]。我们在体外的检测发现：袋装型产品G-W和传统卷烟TPM可抑制该种细菌的数量。之前Sintija等研究显示无烟气烟草（snuffs）与吸烟人群口腔内高水平的牙龈卟啉单胞菌相关[25]。但我们的研究结果显示口含烟虽然在吸食时对唾液中牙龈卟啉单胞菌数量有所影响，但1h后均回复到吸食前水平，这说明短期吸食口含烟并不会对口腔内的牙龈卟啉单胞菌造成不可逆转的影响。

此外，不同类型的烟草制品由于吸食方式不同，对口腔微生物造成的影响也是有所差异。Liu等发现snuffs具有剂量依赖的抑菌性，而snus无抑制效果[15]。本文虽然在体外检测时几种口含烟均对口腔疾病相关微生物影响不大，但在体内吸食过程中，口腔唾液的微生物含量还是有所波动，这种波动可能来自于产品在吸食过程中对口腔的直接物理作用，如胶基型烟草制品由于其具有粘附特性，因此可能会粘附一些牙齿及牙龈上的细菌，并随着胶基型制品的吐出而清除。这也提示我们可以在口含烟的研发过程中主动添加一些针对性的抑菌物质从而达到抑制致病微生物生长的作用。

4 结论

体外实验显示口含烟提取物对于体外变形链球菌无显著性影响，对于牙龈卟啉单胞菌仅有袋装型口含烟具有不同程度的抑制作用，而传统卷烟TPM对这两种细菌都有一定的抑制作用。

对志愿者的研究表明，吸食传统卷烟和含片型口含烟时，唾液总细菌数、变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌数变化趋势基本一致，即开始时较少，随后逐步恢复至吸食前水平；吸食胶基型口含烟时，唾液总细菌数、变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌数都是先升高再逐渐回复到吸食前水平；吸食袋装口含烟时，唾液总细菌数是先下降再回复，而变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌数则是先稍有上升再逐渐回复到吸食前水平。