超临界CO2萃取技术在植物源农药提取中的应用

姚 众，董晨晨，张贵云，张丽萍，刘 珍，范巧兰，吕贝贝

（山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000）

随着现代化农业的发展，农药残留和土壤重金属超标等问题日益受到国内外的广泛关注。国内农业生产以散户种植为主，由于操作不规范，且化学农药使用次数和用量超过限量标准，极易造成环境污染、3R 问题（Residue，Resistance，Resurgence）等。因此，对环境友好、对非靶标生物安全、不易产生抗药性、促进作物生长并提高抗病性的植物源农药日益受到重视[1]。

植物源农药是指利用从植物中提取的活性成分或其次生代谢产物加工而成的制剂[2]。中国地大物博，植物资源丰富，研究植物源农药具有得天独厚的优势。目前，我国有很多科研机构和企业在进行植物源农药相关的研究，筛选出多种具有高效杀虫、杀菌、除草活性的植物，同时更加注重对植物源物质特殊生物活性的发现[3]。而且，市面上已有多种植物源活性成分的农药取得登记并成功应用，如苦参碱、印楝素等。传统的植物源农药提取方法（如溶剂提取法、水蒸气蒸馏法[4]等）提取率不高、工序复杂、周期长。超临界CO2流体（SCF-CO2）萃取技术作为一种新型的萃取分离技术具有保持生物活性、提取率高、操作简便、效率高等优点，适用于提取植物源农药，尤其适于稳定性差的活性物质。葛发欢等[5]用超临界萃取法研究了从黄山药中萃取薯蓣皂素的最佳条件，与传统的汽油法相比，不仅提取率提高了1.5倍，而且避免了使用汽油这种危险化学品易燃易爆的危险。郭清泉等[6]利用降香植物的根和茎，采用超临界萃取法进行提取，并与水蒸馏法对照，超临界萃取法较水蒸馏法大大提高了样品的提取率。

1 SCF-CO2萃取技术概述

超临界流体（Supercritical Fluid，SCF）是一种温度和压力均高于其临界状态，介于气体与液体之间的流体。超临界流体兼具气体和液体的双重特性，其密度与液体相近，黏度和气体相近，但其扩散系数约比液体大100倍。基于溶解过程中发生的分子间相互作用、扩散作用等因素，使得SCF对许多物质都有很强的溶解能力。超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）就是基于SCF的理化特性，将其作为萃取剂，从液体或固体物质中分离出特定成分的一种新型分离技术[7]。CO2以无毒、无害、易于分离、临界温度（31.4℃）接近室温、临界压力也不高（7.38 MPa）等优势，成为应用最广、最多的一种超临界流体[8]。超临界CO2流体萃取（SFECO2）利用SCF的强溶解能力特性，可以从植物中提取多种有效成分，再通过减压、升温等步骤将萃取物分离出来，从而获得目标物质。

1.1 SCF-CO2萃取原理

SCF-CO2对溶质的溶解度受其密度影响。当其处于临界点附近时，压力和温度的细微变化使得其密度随即发生变化，从而导致溶解度的改变。因此，可通过对温度或压力的调节来改变SCF-CO2的溶解能力[9]，使其溶解度在较大范围（100～1 000倍）内得到提高，选择性地萃取不同沸点、极性、相对分子质量的物质。一般情况下，SCF-CO2的溶解能力随其密度的增大而升高。恒压状态下，温度升高，溶质的溶解度减小；恒温状态下，压力升高，溶质的溶解度增大[10]。

1.2 SCF-CO2萃取植物源农药的优越性

SCF-CO2萃取技术在植物源农药的提取中与传统方法相比，具有一系列的独特优点：首先，CO2的超临界温度较低（31.4℃），方便在接近室温且有CO2气体笼罩的环境下进行萃取，实验条件温和，不会破坏溶质中的生物活性物质，在防止热敏性物质氧化和逸散上效果良好，所以，特别适用于一些低挥发度和热敏性物质的分离和精制[11]；其次，CO2简单易得、经济适用，无毒、无害，不产生残留物，萃取过程对人体无害，对环境无污染，是纯天然萃取技术[12]；第三，SCF-CO2萃取选择性好，通过对压力和温度的控制可以改变超临界CO2的密度，进而影响其对物质的溶解能力，实现针对性地萃取植物中目标物质，萃取过程中，通常无相变的过程，只涉及显热，且SCF-CO2在整个循环过程中温差小，便于实现热量回收，节省能源[13]；第四，萃取和分离可一步完成，萃取产品的纯度较高。通过选择适当的压力、温度和夹带剂，可提取出高纯度的目标产品，尤其适用于植物源农药中活性物质的精制[14]。

2 SFE-CO2在植物源农药提取中的应用

由于超临界CO2流体萃取技术具有如上诸多优点，近年来其在植物源农药提取中得到了广泛的应用。

2.1 萜类化合物的提取

萜类化合物是异戊二烯的整数倍的烃类化合物及其含氧衍生物，是一种天然化合物，广泛存在于植物体内，特别是针叶树中。作为植物源农药的有效成分之一，其具有破坏害虫信息传递和交配、内吸、拒食、麻醉、抑制生长发育、触杀和胃毒作用。萜类化合物热稳定性较差，传统的提取方法不但提取率低，且易引起有效成分的分解、变质和挥发。SFE-CO2可利用CO2临界温度接近室温的特性，高效萃取出萜类化合物，既省时又省力。印楝素是世界上公认的活性最强的植物源杀虫剂[15]，美国农业部称其为“可解决全球问题之树”[16]，属于四降三萜类化合物，在光照、高温、水分等条件下极易分解失活。徐勇等[17]研究表明，SFE-CO2与传统的溶剂萃取法相比，设备简单、成本低、不会破坏印楝素的生物活性组分、无有机溶剂污染，适合工业化大量连续生产。赵淑英等[18]从印楝中提取印楝素，以甲醇为夹带剂，在2.3 MPa，32℃，CO2流量为10 m3/h条件下萃取2 h得到印楝素粗提物，其室内杀甜菜夜蛾的活性比利用微波辅助提取等其他萃取方法得到的高，且提取速度快、效率高、易分离。吕兆林等[19]用SFE-CO2从油松针叶中萃取以α-蒎烯和β-石竹烯为代表的萜烯类化合物，在萃取压力15 MPa、萃取温度40℃、萃取时间20 min时，萃取率较高，比水蒸气蒸馏省时且样品回收率高。

2.2 黄酮类化合物的提取

黄酮类化合物广泛存在于自然界，是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物，通常能与植物体中的糖结合成苷类，也有一些以游离态（苷元）形式存在。绝大多数植物都含有黄酮类化合物，该物质在植物的营养生长、生殖生长和抑菌防病等方面有重要作用。通过SFE-CO2萃取植物源农药中的黄酮类化合物，此方法较传统方法操作简单，萃取分离可一步完成，产品纯度高。MARIA等[20]通过传统的压榨、超临界流体萃取和微波萃取等不同方法萃取黄连碱，结果表明，超临界萃取法萃取出的黄连碱含量最高。SFE-CO2萃取苦荞中黄酮类化合物，当苦荞颗粒0.3 mm，添加无水乙醇3%为夹带剂，50℃，30 MPa条件下萃取120 min，萃取率（1.2%左右）达到最大[21]。韩凤麟[22]用SFE-CO2萃取墨旱莲中黄酮类化合物的最佳工艺条件为：萃取温度40℃，萃取时间2 h，夹带剂80%乙醇，乙醇流量为0.4 mL/min。在提取红薯叶黄酮中，当萃取温度50℃，萃取压力30 MPa，夹带剂80%乙醇，CO2流量15 L/h时，黄酮得率6.25%[23]。由文颖等[24]提取山楂核黄酮的研究中，每50 g原料加入75%乙醇75 mL，萃取时间为90 min，萃取温度40℃，萃取压力25 MPa，黄酮提取率为3.308%。甘蔗叶中黄酮类化合物的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数为70%，料液比1∶40（g/mL），浸取时间为3.0h，浸取温度为70℃，在此条件下甘蔗叶黄酮类化合物提取率可达5.81%[25]。

2.3 精油类化合物的提取

植物精油是植物组织中随水蒸气蒸馏而出的成分,包括酚、酸、醛、醇以及芳香族化合物类等[26]，具有植物特征性气味，常温下为易挥发的油状液体，带有芳香气味，几乎不溶于水，但可溶于多数有机溶剂和高浓度乙醇中。此类物质具有毒杀、拒食、抑制生长发育和昆虫性外激素的引诱作用。李兵[27]在提取土荆芥精油时，得出粒度0.25～0.42 mm，萃取参数分别为，压力20 MPa，温度55℃，分离压6 MPa，分离温度60℃，萃取时长65 min，CO2流量为34～36 L/h，此条件下萃取率为7.92%。SFE-CO2萃取较传统方法提取率较高，且避免了提取中油脂成分氧化、酸败和有机溶剂残留等问题。贾秀艳[28]研究表明，SC-CO2萃取薄荷精油的最佳工艺条件为CO2流量为35 kg/h、萃取温度40℃，萃取压力35 MPa、萃取时间2.5 h，此条件下薄荷精油提取率为3.32%。强磊[29]分别利用单因素和响应面试验设计方法，将超临界CO2流体萃取野胡萝卜籽精油的工艺进行了优化，确定其最佳工艺条件：萃取压力13.46 MPa、萃取温度40.16℃、夹带剂添加量为3.25%，野胡萝卜籽精油得率预测值为17.68%。江志利[30]研究表明，样品量为1 g时，SC-CO2萃取木姜子植物挥发油的较佳工艺条件为：采用先静态后动态的萃取方式。静态萃取压力27.58 MPa，时间10 min；动态萃取压力27.58 MPa，萃取温度55℃，CO2体积40 mL，挥发油最佳得率为7.85%。徐敬东[31]采用水蒸气蒸馏提取和CO2超临界流体萃取2种方法，进行紫藤种子挥发油的提取。结果表明，SC-CO2萃取温度40℃、萃取压力25 MPa，乙醇含量5%，提取时间2.5 h，此条件下精油提取率为10.50%，水蒸气蒸馏提取的提取率为0.011%。超临界提取的提取率远远大于水蒸气蒸馏提取，存在明显差异。通过GC-MS分析发现，2种提取方法得到的精油成分具有较大的差异，超临界提取精油对3种真菌的抑制活性均优于水提精油。

2.4 生物碱的提取

生物碱是存在于自然界中的一类含氮的碱性有机化合物，有类似碱的性质，大多有复杂的环状结构，是植物源农药中重要的有效成分之一。生物碱是植物次生代谢产物中较大的一类，目前从植物中分离出来的生物碱有5 000～7 000种[32]。通常生物碱类在植物源农药中杀虫毒力最强，一般通过毒杀、拒食、麻醉和抑制生长发育等方式作用于昆虫。苦参碱、氧化苦参碱作为广谱杀虫剂，用于防治黏虫、菜青虫、蚜虫等，主要来源于苦参、山豆根等。刘修树等[33]运用正交试验法探讨SC-CO2萃取苦参中苦参碱的最佳工艺：将苦参药材粉碎后过0.25 mm筛，加0.5 mL/L氨水浸润过夜，4倍量75%乙醇（V∶V）作为夹带剂，在 25 MPa，60℃，萃取 3 h，CO2流量40 kg/h时，萃取物中苦参碱含量最高，为22.97～24.23 mg/g。蔡智慧等[34]研究表明，通过正交试验确定了披针叶黄华总生物碱SC-CO2流体萃取的最佳工艺为：萃取温度45℃，萃取压力20 MPa，CO2流量20 kg/h、萃取时间80 min，此条件下总生物碱得率为3.12%。佟若菲等[35]研究发现，黄连生物碱最佳萃取工艺条件为：萃取温度60℃，萃取压力30 MPa，物料粒度 0.25～0.42 mm，萃取时间 1.5 h，此条件下黄连中生物碱萃取率为14.24%。ARVIND等[36]测定，长春花生物碱最适宜萃取条件：25 MPa，40 min，80℃，夹带剂为甲醇，提取率4.1%。盛桂华等[37]通过4因素3水平的响应曲面试验设计，研究分步SFE-CO2萃取山豆根中苦参碱的最佳工艺：山豆根干燥粉碎后，按料液比2∶1加入0.1 mol/L氨水浸泡过夜后过滤，滤渣投入萃取釜，每隔1.5 h取样1次，共取2次，第1步萃取温度80℃，萃取压力45 MPa，以100%乙醇（V∶V）为夹带剂，用量80 mL/100 g；第2步萃取温度30℃，萃取压力25 MPa，夹带剂不变，该条件下萃取苦参碱萃取率达96%。大多生物碱以盐的形式存在于植物组织中，在SFE-CO2萃取时，提前用碱化剂（如氨水、Na2CO3和Ca（OH）2溶液等）处理原料，使原来与酸结合的生物碱盐转变成游离态，增加其在SFE-CO2中的溶解度，以提高萃取效率。

3 展望

超临界CO2萃取技术因为其环保、生产安全、不会损害产品活性、提取效率高等特点受到广泛关注，已经成为植物源农药提取中一种非常具有发展潜力的高新提取分离技术。但是在植物源农药的提取中依然有其自身的局限性，对于许多极性较强的物质尤其是生物碱类物质很难进行有效的萃取分离，需要加入适合的夹带剂，提高萃取率。何雁等[38]探讨SFE-CO2萃取丹参酮的最佳工艺条件，采用均匀设计法对影响萃取结果的因素进行考察，发现夹带剂用量影响萃取结果最为显著，当夹带剂用量10%时，萃取效率最高。所以，今后应在夹带剂方面进行重点研究，可以在夹带剂类型、用量和浓度等不同条件下对比萃取率，得出不同成分的最佳萃取工艺。

超临界CO2萃取技术因其设备投资大，未能普遍应用，并在萃取时常需要加入夹带剂，影响溶剂的溶解度和选择性，因此，需要依据大量的实验数据选择合适的夹带剂和用量[39]。大量的实验数据依托于试验设计和优化方法。目前，国内研究常用的方法有正交设计、星点设计、均匀设计以及响应面设计法，这些方法在优化植物源农药的提取中得到广泛应用[40]。不同的试验设计和优化方法各有自身的优势和局限，因此，我们应根据不同需要选择适宜的萃取方式和优化方法，这样能极大地提高工艺优化的效率和准确性。另外，可以将超临界CO2萃取技术与传统方法有效结合，优势互补，大大提高萃取效率，对于促进超临界CO2萃取技术的发展有重要意义，也将推动植物源农药的研究向更高层次发展。