尿路感染检测方法研究进展

雷 佳，刘世巍，邓秀敏

中国中医科学院望京医院肾内科(北京 100102)

主题词 泌尿道感染 生物学鉴定法 质谱法 药物耐受性 聚合酶链反应

尿路感染是最常见的社区获得性和医院获得性感染之一，超过50%的女性一生中至少经历过1次尿路感染[1]，而曾患UTI的女性患者中高达25%会在随后的日常生活中出现复发[2]。在美国，尿路感染每年造成的花费高达35亿美元[3]，占相当大额度的医疗保健支出，加之其高发病率及复发率，为公共卫生系统带来了沉重负担。

目前，诊断和治疗尿路感染的主要手段仍依赖于尿培养的结果，但此方法从鉴定病原体到药敏试验(Antimicrobial susceptibility test，AST)总共至少需要42～78h[4]。临床工作者，往往平均3d才能获得致病菌及其药敏结果。因此，经验性的使用广谱抗生素使得病原菌耐药甚至多耐药日趋严重。耐药和耐多药的病原体的出现更是造成全球范围内的医疗保健威胁[5]，因此，快速鉴定病原体及其抗菌药物敏感性的技术成为尿路感染患者精确诊断、优化治疗以及改善抗生素滥用的迫切需求。近年来，即时检验技术、分子生物学技术等新型检测技术的发展及应用将为尿路感染的诊治带来福音。现将上述检测手段综述如下。

1 菌尿即时筛选技术

即时检验(Point of care testing，POCT)是当今临床检验发展的趋势之一。POCT不单纯以提高检测精度为目标，而且对于推动个体化化医疗和疾病筛查等具有重要意义[6]。对于尿液标本的快速筛选不仅可以简化微生物室的试验流程，也可以减低成本，从而达到提高检验效率的目的。

1.1 侧流免疫层析 侧流免疫层析(Lateral flow chromatographic assay ，LFCA))是一种将免疫标记技术与色谱层析技术等相结合的固相膜免疫分析技术，该技术需通过标记物获取信号数据以分析结果，具有成本低廉、 操作简便、检测结果敏感性高和快速等优点[7]。近年来，高灵敏度的光信号、磁信号、电化学信号探针的应用使得LFCA的灵敏度和精准度取得了长足进步，尤其是纳米粒子应用和发展，其被看作是LFCA的示踪剂[8]。国外文献报道早在2015年，新型的横向流动分析(RapidBac)技术已应用于兽医行业，目前正在人体研究中进行评估，未来将应用于快速的菌尿检测[9]。RapidBac技术[9]对966份人体尿液标本进行了鉴定，发现尿液标本细菌量≥103cfu/ml的灵敏度为86%，特异性为94%；革蓝氏阴性菌细菌量≥104cfu/ml达到96%。这些数据对于LFCA未来在人体尿液检测带来了希望，下一步仍需通过多中心前瞻性研究鉴定此方法的精准度。

1.2 流式细胞术 流式细胞术(Flow cytometry，FCM)是利用基于光束对细胞或微粒进行参数定量分析和筛选的快速检测技术，具有快速、灵敏、精确等突出优点。在国外，FCM已广泛应用于细菌常规检查[10]，而我国起步较晚。常规细菌计数方法主要是国家标准推荐的平板法[11]和通用的显微技术，FCM可以同时克服传统方法耗时长和误差大的缺点，快速得到细菌总数，若检测的是一定体积样品中的菌数，即得知菌浓度[12]。通过流式细胞术初步筛选尿液样本可以减少进一步分析的样本数量来改进临床实验室工作流程，然而，流式细胞术仅仅是筛查菌尿，它不能够提供病原体鉴定和药敏试验来进行确定性诊断[13-15]。正在进一步尝试将一些形态信息纳入光散射技术中[16]，例如用十二烷基硫酸钠区分革蓝氏阳性菌和革蓝氏阴性菌的差异以及区分不同杆菌的光散射图案[17]，但是这些技术是仍是实验性的，有待于进一步研究应用于尿液检测。

2 分子生物学技术

分子生物学技术已使病原微生物的检测达到了DNA、RNA水平，其在很大程度上可以提高检验范围与精度。已有研究证实许多病原微生物对特定抗菌药物耐药性具有一定遗传基础[18]，这一理论可以通过靶向病原体特异性分子标记来识别病原体。MALDI-TOF质谱、荧光原位杂交和聚合酶链反应、基因芯片技术早已应用于一些病原微生物感染的诊断。由于人类尿液标本pH值、电解质浓度、细胞组成等差异的存在，导致利用上述技术检测尿液标本之前需要分离细菌细胞[19-20]。目前上述方法已在实验室中进行研究，未来利用该方法直接检测尿液，从而达到诊断尿路感染的目的将成为可能，并且该法时效性和精准性或优于现有尿培养方法[20]。

2.1 多重聚合酶链反应 聚合酶链反应(Plolymerase chainreaction，PCR)作为体外核酸扩增技术其灵敏度和特异性使得能够检测到罕见的靶标。国外有研究提出多重PCR通过同时加入多对引物，扩增不同细菌特异性片段来同时快速检测各种细菌，可直接对液体血培养物进行提取检测，更适合一般临床实验室对病原菌的鉴定及初筛[21]。部分公司正在研究Septi Fast(实时PCR)技术用于直接检测尿路感染患者尿液标本[22]。为了探索该平台对UTI诊断的可能性，利用Septi Fast直接检测了疑似尿路感染患者的82份尿液标本，结果发现灵敏度和特异性分别为82%和60%[22]。由于临床中患者对尿液标本的收集方式使得尿液标本存在污染的可能性，造成PCR结果易出现假阳性可能，因此在利用PCR检测尿液标本之前要对细菌进行量化。实时定量PCR法可准确定量标本中特殊核酸的拷贝数的特点来测量细菌生长量的方法，以此来判断药敏结果，这给临床微生物药敏试验提供了新的思路。

2.2 荧光原位杂交 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH )是一项利用探针直接在染色体、细胞或组织水平定位靶序列的分子生态学技术，能够对复杂的难培养和未培养的微生物进行菌种鉴定、数量及细胞形态等进行分析。hemoFISH和QuickFISH已被FDA批准用于鉴定血液中的病原微生物，hemoFISH使用DNA探针，而QuickFISH分析是基于肽核酸(PNA)探针，Quickfish可在20min内检测标本，灵敏度和特异性>96%[23-25]。Quickfish可直接快速检测尿路感染患者尿液中高浓度的细菌，但现有数据表明FISH是受限于无法纳入药敏分析[26]，因此，未来用于尿路感染的诊断仍存在挑战。

2.3 MALDI-TOF MS质谱技术 MALDI-TOF MS以蛋白质为靶标分子已应用于大肠埃希氏菌的检测[27]。Ferreira等[28]选取尿液中细菌大于105cfu/ml标本进行研究，结果显示尿标本经过差速离心法处理后，可将91.8%的菌株鉴定到种。Lotz等[29]的研究显示，对菌株进行相应的标本前处理之后，MALDI-TOF MS对于分枝杆菌鉴定的准确率可达97%；其中67%可鉴定到种的水平，30%可鉴定到复合体的水平。由于大肠埃希菌和志贺菌的蛋白质谱图很相似，两者无法通过MALDI-TOF MS区分；其次，仪器的初始购买价格很高，标本前处理过于复杂，虽然MALDI-TOF MS已大型临床实验室中使用，但利用质谱诊断早期尿路感染的价值并不高[29]。

2.4 微流控芯片 “微流控芯片”这一概念是由Whitesides[30]研究团队首次提出的。近年来，其逐渐发展成熟，凭借分析快速、成本低、消耗低、重现性好、通量高、多功能、集成好并可以在接近生理环境下运行等特点，成为近年来热点前沿分析技术之一[31]。文小霞等[32]人选用4种尿路感染常见病原菌作为模拟测试对象，通过实验研究发现这种芯片方法在15h内可完成细菌鉴定，检测限可达101cfu/ml。齐明月等[33]人以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌为模拟测试对象进行分析，结果表明，芯片方法可以在18h内实现对3种细菌的同时鉴定及6种抗生素敏感性测试，与传统细菌鉴定方法和抗生素敏感性测试结果一致性分别为94.1%和93.9%。随着纳米技术的发展，利用纳米荧光标记探针可有效克服芯片检测中面临的低灵敏度和低选择性的两重限制，实现病原微生物多位点和多对象的鉴定。

3 总结与展望

综上所述，尿路感染的高发病率、高复发率及其造成的庞大医疗支出等因素促使尿路致病菌的快速、实时、精准检验成为目前临床诊治的关键；其次，改善和遏制病原微生物耐药和多耐药情况也依赖于即时检验手段的发展。菌尿即时筛选技术，如侧流免疫层析、流式细胞术的应用减少了微生物实验室的检验流程，节约了实验成本，更重要的是缩短了检验时间，使尿路感染检测“实时”化发展；分子生物学技术的发展，使得检验水平的特异性、灵敏性和自动化有所提高，其与纳米技术的结合更使检验范围扩展化，使尿路感染的检测趋向于“精准”化。然而由于各地医疗环境的限制，我国目前仍以传统的检测手段为主，上述新兴技术仍局限于实验室水平；其次，由于检验设备费用昂贵，部分技术标本检测前的处理步骤复杂，二级、一级甚至社区医院想要实现新兴技术的应用仍面临挑战。未来一旦，这些问题能够解决，开发和应用上述快速，精准的尿路感染检测手段将有助于临床诊断和治疗。早期精准的治疗过程不仅有利于患者的预后，而且有利于改善临床中抗生素滥用和管理。尿路感染的精准治疗依赖于实验室诊断，而精准的诊断离不开上述检测手段的发展，在及时的时间应用正确的药物是尿路感染患者治疗的关键。