高尔基体病变与肌萎缩侧索硬化症

宋彬彬，李阔，刘新秀，唐甜甜，贺菲菲，胡月青，杨璇，于佳

高尔基体是由多个扁平囊泡组成的具有极性的亚细胞器，负责将内质网合成的蛋白质进行加工、分选并投递到细胞质膜、内体、溶酶体等部位，对于神经元的发育和正常结构功能的维持至关重要。肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是累及大脑皮质、脑干和脊髓运动神经元的神经退行性疾病。研究发现在ALS早期即发生高尔基体病变，可能与运动神经元的变性死亡有关。本文将对神经元中高尔基体形态、结构、功能及其与ALS的关系进行综述。

1 神经元中的高尔基体

1.1 高尔基体形态结构及相关蛋白

高尔基体是广泛存在于真核生物中的呈扁担或哑铃型的单层膜状亚细胞结构，由5～8个直径约为1 μm的扁平囊泡/潴泡（cisterna）堆叠形成高尔基体堆（Golgi stack），其是高尔基体的主体，高尔基体堆可通过侧面的膜管状结构连接形成高尔基体带（Golgi ribbon）。神经元细胞中有多个高尔基体堆，通常围绕核周和中心体附近聚集，在树突中也有分布，是与胞体内高尔基体离散的不连续结构体，称为“外驻”高尔基体（Golgi outposts），轴突中虽观察不到高尔基体超微结构，但仍可检测到高尔基体相关蛋白和高尔基体样功能[1]。高尔基体具有高度极性，是精细的稳态膜结构，可分为顺面高尔基体网（cis-Golgi network，CGN）、高尔基体中间囊膜（medial Golgi stack）及反面高尔基体网（trans-Golgi network，TGN），其形态结构的维护主要依赖3类蛋白：高尔基体结构蛋白、微管及微丝相关蛋白和高尔基体运输相关蛋白。

1.1.1 高尔基体结构蛋白 高尔基体结构蛋白包括Golgin家族蛋白和GRASP（Golgi reasembly and stacking proteins）家族蛋白。Golgin家族蛋白如Golgin-45、 Golgin-97、 Golgin-160、 GM130 和Golgin-67、Golgin-84、giantin等具有卷曲螺旋结构，构成高尔基体骨架[2]，其中GM130是常用于检测高尔基体形态的标志性蛋白，小鼠神经元中特异性敲减GM130的表达会引起高尔基体碎裂和错位[3]。GRASP蛋白是由N端的GRASP结构域和C末端尾巴组成，其中GRASP结构域包含2个PDZ结构域，其对于高尔基体堆的拴连是必须的，如Grasp65的PDZ结构域可与GM130结合，Grasp55 PDZ结构域可与Golgin-45结合，从而正调控囊泡的堆叠和膜联通，维持高尔基体形态结构[4,5]。

1.1.2 微管及微丝相关蛋白 在多种类型细胞包括运动神经元和海马神经元中的高尔基体都处于胞质微管网络中，是非中心体微管形成部位，也称微 管 组织中心（microtubule organizing center，MTOC）[6]。Ori-McKenney等[7]证实在果蝇IV型树突分支神经元中，树突中外驻高尔基体是非中心体微管成核（Nucleation）的主要位点，并可调控树突的形态；Bellouze等[8]发现神经元中高尔基体部位的微管聚合受损会导致高尔基体碎裂，因此微管及微管相关蛋白对于高尔基体结构和功能维护具有重要作用[9]。而且运动神经元中高表达微管蛋白结合辅助因子（tubulin binding cofactor E，TBCE），TBCE与顺面高尔基体（cis-Golgi）相连，可调控微管聚合及高尔基体结构[10]。此外，微管和微丝是构成细胞骨架的两大主要组分，微丝的主要成分是肌动蛋白，肌动蛋白调节蛋白Mena可与Grasp65相互作用，使Mena被招募到高尔基体膜上，促进肌动蛋白聚合，使高尔基体带间紧密连接，敲减Mena或干扰肌动蛋白聚集会引起高尔基体结构碎裂[11]。

1.1.3 高尔基体运输相关蛋白 高尔基体周围具有大（0.1～0.5 μm）小（40～80 nm）不等的囊泡，与胞内物质运输有关。有被蛋白复合体COPI和COPII主要调控内质网与高尔基体间囊泡运输。COPII形成于内质网输出位点，参与内质网向高尔基体的运输过程，也称早期分泌途径；COPI在高尔基体膜的ERGIC交界处形成，负责回收、转运内质网逃逸蛋白返回内质网，且可介导ERGIC到顺面高尔基体间运输及高尔基体不同区域间蛋白质运输。COP有被蛋白可包裹待分泌物形成囊泡，在衔羁蛋白（P115/GM130）、锚定蛋白（Rab）和融合蛋白（SNAREs）辅助下完成囊泡与目标膜的融合释放。而高尔基体囊泡出芽和融合的失衡会引起高尔基体构架损伤或形成空泡，如当COPI和COPII形成受到抑制时会使高尔基体形成空泡，Rab和SNARE功能受损会引起强烈的高尔基体碎裂[12]。这提示胞内囊泡运输需要高尔基体和内质网等结构稳定，高尔基体运输相关蛋白对于高尔基体形态维护有重要作用。

1.2 高尔基体的生理功能及相关蛋白

1.2.1 蛋白质加工 高尔基体是完成蛋白质加工和包装的最后场所。高尔基体中富含糖基转移酶，是蛋白质进行糖基化的主要部位。GM130可以正调控糖基转移酶C1GALT1和ST3GAL1的表达水平来调控糖基化作用。蛋白质糖基化后产生标记，有利于高尔基体进一步分选和包装[13]。此外，高尔基体中还可进行蛋白质水解剪切，内质网合成的某些蛋白质必需在高尔基体中经蛋白酶特异性水解才能成熟或转变为活性形式[14]，如神经肽前体在神经元内质网和核糖体中合成，需经高尔基体中蛋白酶、肽酶等剪切并加工才能形成有活性肽段。

1.2.2 蛋白质分选和运输 内质网中合成的分泌蛋白以出芽方式形成囊泡进入顺面高尔基体，在高尔基体中间囊膜加工修饰后具有可被识别的分选信号，经反面高尔基体选择分类，再形成不同去向的分泌和运输囊泡到其最终作用部位，如质膜、内体/溶酶体或内质网等，故高尔基体是胞内物质运输的交通枢纽。而高尔基体对于蛋白质的分选和定向运输是一个精密的过程。

货物蛋白经过修饰、加工后具有可被高尔基体专一识别的分选信号[15]，反面高尔基体根据蛋白质上的信号肽或信号斑对蛋白质分类识别，进而形成不同去向的分泌小泡，如反面高尔基体膜上有M6P受体蛋白，可以识别溶酶体酶上的M6P信号，并与M6P结合起到局部浓缩溶酶体酶的作用，实现溶酶体酶的分选，再以有被小泡的形式转运到溶酶体。神经元中各类受体、通道等膜蛋白通过胞体和外驻高尔基体的分选和运输而投送到神经元的胞体、轴突和树突的表面，对于神经元轴突和树突形成以及突触囊泡前体的组装和运输是必须的[16]。

2 ALS中运动神经元发生高尔基体碎裂

高尔基体发生不可逆的结构碎裂是神经退行性疾病中出现较早且持续性的病理特征之一[8]。大量研究证明，高尔基体碎裂是ALS运动神经元的典型病理改变之一：在家族性和散发性ALS患者中可检测到高尔基体形态或相关蛋白表达水平的改变，且发生在临床症状出现之前。早在1990年，Mourelatos等[17]证明ALS患者实验组与健康对照组相比，运动神经元中高尔基体形态发生改变。对照组中高尔基体形成连续的圆形、椭圆形或不规则形状的带状结构，而ALS实验组中高尔基体碎裂成大量较小的圆形或椭圆形结构，且这种形态差异仅限于运动神经元中。定量分析表明，单个细胞中高尔基体结构数量增加，但总表面积减小，并且单个高尔基体表面积也减小，这都说明ALS运动神经元中高尔基体发生碎裂。Gonatas等[18]也发现ALS患者中高尔基体碎裂的运动神经元（约30%）数量较对照组（1%）显著增加。此外，OPTN E478G突变的ALS患者中可发现70%前角细胞中高尔基体碎裂。ALS患者脊髓运动神经元中出现TAR DNA结合蛋白43（transactivating response DNA binding protein 43，TDP-43）核质错位和泛素阳性不溶性积聚，并且伴随高尔基体碎裂[19,20]。

在ALS动物和细胞模型中也可发现高尔基体碎裂。Mourelatos等[21]研究SOD1突变的ALS转基因小鼠模型发现，ALS小鼠脊髓中神经元高尔基体碎裂开始于出生后31 d，约早于临床症状60 d出现，出生后104 d高尔基体严重碎裂并伴随空泡产生，而SOD1 WT转基因小鼠出生后289 d仍未发生高尔基体碎裂。与SOD1 WT转基因小鼠相比，SOD1突变小鼠模型脊髓运动神经元的平均表面积、细胞核表面积、高尔基表面积都显著减小，而单个神经元中高尔基体结构数量显著增加。Van Dis等[22]发现SOD1G93AALS模型小鼠出生后20周前角运动神经元中发生高尔基体碎裂的数目高达30%左右，其中胞体和树突近端都可发现碎裂的高尔基体。Bellouze等[8]发现SOD1G85R和SOD1G93AALS转基因小鼠与非转基因和SOD1 WT转基因小鼠模型相比，出生240 d后脊髓运动神经元中高尔基体出现显著的碎裂和萎缩，高尔基体结构数量增加4倍，而表面积减小约35%。高尔基体相关蛋白β-COP表达水平下降，GM130从高尔基体膜错位到囊泡和胞质。过表达SOD1G85R和SOD1G93A的NSC34细胞模型中也出现高尔基体带碎裂。另外，NSC34细胞中过表达OPTN致病突变型（p.Q398X、p.E478G、p.V295F）也可引起高尔基体碎裂和内质网应激等ALS运动神经元病理性反应[23,24]。

3 ALS中运动神经元发生高尔基体碎裂的机制

神经元中高尔基体正常结构维护需要结构蛋白、微管相关蛋白和运输蛋白等多种因子的协调配合，故ALS患者、动物和细胞模型中观察到的不可逆高尔基体结构碎裂可能是由于维护高尔基体结构稳态的相关蛋白缺陷和异常胞内环境所触发[9]。

3.1 高尔基体结构蛋白缺陷

高尔基体碎裂与高尔基体结构蛋白缺陷有关。ALS运动神经元中caspase家族蛋白可被激活，定位于高尔基体的活化caspase2可剪切Grasp65、GM130、golgin-160和giantin等高尔基体结构蛋白，此外caspase3、7对golgin-160也有剪切作用，但caspase2可快速被激活，剪切作用发生较早，说明高尔基体中caspase2激活是早期事件，其具体机制仍未明确[25,26]，而ALS中高尔基体结构组分破坏会引起不可逆的高尔基体碎裂。

3.2 微管缺陷

高尔基体碎裂可能是由于神经元发生微管缺陷（解聚）或微管依赖的运输受损所引起的[22]。早期研究提出，过表达SOD1G93A小鼠与SOD1 WT小鼠模型相比，运动神经元中高尔基体平均直径变小，与微管干扰药物colchicine效果相似，故提出SOD1突变细胞中高尔基体碎裂可能起源于微管的改变[17]。Bellouze等[8]进一步研究证实SOD1突变的小鼠运动神经元中可发现微管解聚蛋白Stathmin-1/2蛋白水平增加，使微管解聚，变稀薄，引起高尔基体碎裂。过表达SOD1突变的NSC34细胞中加入微管稳定药物Taxol可以减少高尔基体碎裂；敲减Stathmin-1/2可缓解SOD1突变引起的微管不稳定和高尔基体碎裂，NSC34细胞中过表达Stathmin-1/2也可引起高尔基体碎裂。Neuro2a细胞中过表达突变的SOD1可使调控微管稳定性的乙酰化微管蛋白水平下降，高尔基体碎裂。另外，ALS相关蛋白VAPB MSP区域可与微管蛋白tubulin相互作用，致病突变VAPB P56S会减弱tubulin的表达，影响微管生成和稳定性[27]，Hela细胞中敲减VAPB表达会引起强烈的高尔基体碎裂，这可能是由于VAPB与微管相关蛋白相互作用的结果。

3.3 早期分泌途径受损

高尔基体碎裂与高尔基体运输相关蛋白及功能受损有关。正常情况下，分泌蛋白VSVG需从内质网运输到高尔基体，可作为检测早期分泌通路功能的标志性蛋白。Soo等[28]在sALS患者脊髓运动神经元、SOD1G93A转基因小鼠的皮质和脊髓运动神经元以及过表达ALS致病突变TDP43、FUS和SOD1的Neuro2a细胞模型中都发现VSVG主要定位在内质网，囊泡运输过程受阻使其在高尔基体定位减少。且突变的TDP43和FUS主要位于内质网，影响运输通路前期分泌蛋白及COPII有被囊泡的出芽形成过程，而突变的SOD1主要游离于胞浆中，影响囊泡沿微管的运输及与高尔基体膜融合过程。NSC-34细胞中分别过表达SOD1A4和SOD1VG85R可观察到转染16 h后早期分泌途径受损，而高尔基体碎裂出现在转染后18 h，转染后20～24 h细胞凋亡[29]，这提示ALS中早期分泌途径受损早于高尔基体碎裂，可能是引起高尔基体形态改变的原因之一。

3.4 TDP-43蛋白不溶性积聚

近年研究发现，TDP-43是约97%ALS患者的神经元内包涵体的特征性成分[30]，ALS患者运动神经元中形成TDP-43胞质不溶性蛋白积聚，造成TDP-43在细胞核中正常功能缺失，抑制其对多种RNA代谢调控作用，可损伤神经元发育和突触形成等。Fujita等[19]研究发现，高尔基体形态结构与TDP-43定位紧密相关。ALS患者中具有TDP-43阳性的胞质不溶物的脊髓运动神经元发生高尔基体碎裂，而TDP-43仍位于细胞核的神经元中高尔基体结构形态正常，提出ALS运动神经元中TDP-43不溶性积聚与高尔基体碎裂关系密切。Tong等[31]在TDP-43M337V转基因大鼠海马和皮质神经元中发现泛素化阳性积聚，且高尔基体对于TDP-43突变较敏感，发生碎裂。这提示TDP-43突变或形成胞质不溶性积聚可能由于功能缺失或毒性获得引起高尔基体碎裂，但其具体机制有待深入研究。

4 ALS中高尔基体碎裂与运动神经元变性死亡

ALS早期运动神经元中发生高尔基体分解和碎裂，这可能与ALS发病过程中运动神经元变性死亡紧密相关。研究发现，大鼠皮质神经元中过表达蛋白激酶抑制剂H89和PKI以及高尔基体结构蛋白Grasp65可抑制高尔基体碎裂，从而减少和延缓神经元死亡，且抑制线粒体或内质网相关细胞死亡通路会减弱高尔基体碎裂，这提示细胞器间具有相互作用，高尔基体可能是神经元死亡的效应因子之一[32]。ALS中运动神经元高尔基体碎裂可能伴随功能缺失，抑制高尔基体对蛋白质和脂质的分类、加工和运输，使轴突和树突形态结构受损，并可能在一定程度或某种情况下引起轴突内紊乱、自噬功能障碍或凋亡等使神经元变性死亡。

4.1 轴突内紊乱

轴突内稳态对于维持神经细胞正常形态和功能至关重要，而ALS神经元中轴突运输缺陷[33]，轴突从远端向近端的逆行死亡或逐渐变性与运动神经元受损紧密相关。研究发现，SOD1突变的ALS小鼠模型中，快速易疲劳神经元具有更长的轴突和更高的代谢需求，最易发生轴突变性，且远端轴突病变和神经肌肉接头去神经支配发生在临床症状之前[34]。而神经元中胞体和外驻高尔基体可分泌运输轴突膜蛋白，调控轴突的形成。海马神经元中加入BrefeldinA促使高尔基体碎裂后会减弱突触电活动（synaptic potentiation）和突触后膜上AMPA受体的表达以及轴突生长[35]，故高尔基体可调控轴突内稳态，高尔基体碎裂可能使蛋白和脂质向远端轴突运输受损而使轴突变性损伤。van Dis等[22]证明ALS小鼠模型运动神经元的胞体和树突中高尔基体碎裂伴随胞内运输缺陷，且早于轴突回缩和肌肉去神经支配现象。此外，高尔基体膜富含的磷脂PtdIns4P对轴突运输过程中Retromer复合物亚基SNX6和动力蛋白激活蛋白（dynactin）最大亚基p150Glued的结合具有负调控作用，能够促进Retromer和dynein/dynactin这2个蛋白质复合体的解离，在货物卸载环节具有重要的调控作用[36]。所以ALS早期运动神经元中高尔基体结构碎裂引起蛋白分泌及高尔基体相关蛋白功能障碍可能是触发轴突内紊乱，引起运动神经元变性的重要原因。

4.2 自噬功能障碍

自噬是细胞中降解错误折叠蛋白质和受损细胞器等的重要方式，以维持细胞正常生命活动。自噬发生时首先形成双层膜泡，膜泡扩张形成自噬小体后可吞噬受损的蛋白、细胞器或病原体，并与溶酶体结合后将物质降解。自噬过程中自噬体膜成分主要来源于内质网，而高尔基体可运输自噬体膜成分，主要促进膜的延伸扩张。自噬早期阶段，自噬相关蛋白LC3结合到反面高尔基体膜网络，随后脱离形成LC3阳性囊泡参与自噬过程。衔接蛋白AP1（adapter protein）介导反面高尔基体网格蛋白小泡形成，可通过调控LC3阳性囊泡形成为自噬小体提供膜来源[37]，且反面高尔基体上的Beclin1也可进一步招募自噬小体合成所需的其他自噬相关（autophagy-related，Atg）蛋白[38]。反面高尔基体还可识别并分类溶酶体酶，调控溶酶体形成，进一步证明高尔基体可调控自噬[14]，故高尔基体可调控自噬小体形成，ALS中运动神经元自噬缺陷可能是由于高尔基体结构和功能异常引起。而另有研究者发现高尔基体碎裂可能会增强自噬。Takahashi等[39]发现Hela细胞在饥饿诱导的自噬条件下，高尔基体碎片会增加自噬体生物合成；Naydenov等[40]证实Hela细胞中用Brefeldin A或Golgicide药物诱导高尔基体碎裂会增加自噬体合成和积累。这提示运动神经元中高尔基体碎裂可能引起自噬功能障碍（过高或过低）有关，二者具体相关性需要深入研究。

4.3 凋亡

有研究发现ALS中高尔基体碎裂通常早于细胞凋亡[22,29]，所以高尔基体碎裂可能是触发运动神经元凋亡因素之一[14]。运动神经元中高尔基体可感受和传导压力信号，产生应激反应，当压力持续存在时，高尔基体结构和定位异常改变，使其功能障碍，可减弱神经酰胺运输和鞘磷脂等的合成，改变膜性质，还可促进内质网合成的脂质神经节苷脂GD3等转运到高尔基体后再到线粒体，改变线粒体膜通透性而诱导细胞凋亡。此外，高尔基体具有多种凋亡相关蛋白[2]：caspase蛋白家族中主要凋亡起始者caspase2位于高尔基体，其对高尔基体碎裂和细胞凋亡信号有关键作用；凋亡抑制蛋白Apollon/BRUCE（BIR repeat containing ubiquitin-conjugating enzyme）位于高尔基体，可负调控caspase2的激活；细胞死亡受体如肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor-1，TNFR1）和Fas定位于稳定状态的高尔基体，还有部分Hippi（Hip-1 protein interactor）位于高尔基体，Hippi与游离的Hip相互作用可激活caspase8而引起神经元凋亡，这提示高尔基体可感知凋亡信号，但凋亡信号是否来自高尔基体的裂解仍未有确切定论。研究发现，Hela细胞中过表达caspase抵抗的未剪切的突变golgin-160会延缓内质网应激或死亡受体通路引起的凋亡，但突变的golgin-160抗凋亡作用并不是主要依赖于对高尔基体分裂的抑制，而是因其在凋亡通路早期对caspase活化有抑制作用[41]。Jeremiah等在海马鱼胚胎中过表达ALS致病突变Optineurin（OPTN）25 hpf（受精后）发现胚胎形态发生细微改变，细胞凋亡数量显著增加，但高尔基体形态未发生改变[42]。此外，活化的caspase3可以剪切p115蛋白引起高尔基体碎裂，而且产生p115 C末端片段可在细胞核中积累，进一步诱导凋亡，可能形成恶性循环[43]。因此，ALS中运动神经元高尔基体碎裂与细胞凋亡的因果关系复杂，需要进一步深入研究。

5 结论与展望

高尔基体是细胞中复杂膜结构，是胞内蛋白质合成加工的最终场所和物质运输的重要交通枢纽，对于神经元结构、功能的形成和维护有重要作用。ALS运动神经元中发生高尔基体结构蛋白缺陷、微管解聚、早期分泌途径受阻及TDP-43胞质不溶性积聚等可能引起高尔基体结构分解碎裂，是ALS显著病理特征之一。而且高尔基体碎裂可使运动神经元轴突紊乱、自噬障碍等，但高尔基体碎裂与运动神经元变性死亡的因果关系仍未有确切结论，研究者可以在ALS体内或体外模型中抑制或促进高尔基体碎裂后分析运动神经元变性和死亡程度，为二者间相互作用的研究提供参考，以期深入了解ALS中高尔基体碎裂与运动神经元变性死亡的关系。