表皮生长因子受体组织基因突变状态与自体细胞免疫联合序贯化放疗治疗肺癌骨转移效果的关系分析

苗栓林,曹晓朋,胡丽芳

非小细胞肺癌是我国最常见、病死率最高的恶性肿瘤,其主要类型包括腺癌、鳞癌等小细胞肺癌，约占全部肺癌的80%[1]。由于非小细胞肺癌早期临床特征不明显，其检出率和诊断率低下，患者确诊时多为中晚期并伴转移，其中肺癌骨转移是其最常见的转移类型之一，可导致常规手术治疗、放化疗效果欠佳，严重威胁患者的生命安全[2]。由于肺癌骨转移患者自身条件普遍较差，故放化疗治疗相对受限[3]。细胞免疫治疗作为新型治疗技术，对多种恶性肿瘤疗效满意，本研究选择自体细胞免疫治疗(cytokine-induced killer, CIK)联合序贯放化疗治疗肺癌骨转移，探讨其应用效果与病理组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变状态的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2015年1月—2017年2月延安大学咸阳医院收治的肺癌骨转移91例，男51例，女40例；年龄(48.3±11.6)岁；病程(3.72±1.65)年；病理类型：腺癌48例，小细胞肺癌30例，鳞癌13例；转移情况：肋骨转移32例，胸椎转移28例，腰椎转移25例，骨盆转移6例。纳入标准：①根据临床表现和肺癌组织病理活检确诊肺癌，同位素全身骨扫描确诊肺癌骨转移；②符合CIK治疗、序贯化放疗适应证；③患者和家属均具备独立行事能力，了解治疗风险，愿意配合治疗研究。排除标准：①存在骨结核、骨折、骨恶性肿瘤等疾病；②存在精神心理疾病，难以配合治疗。本研究已获医院伦理委员会批准。

1.2治疗及检测方法

1.2.1序贯放化疗治疗方法：全部病例评估治疗潜在风险、相关治疗适应证，给予序贯放化疗治疗，即NP化疗方案：酒石酸长春瑞滨注射液(江苏豪森药业股份有限公司，国药准字：H20031337)30 mg/m2静脉注射，第1 d、第8 d；注射用顺铂(山东凤凰制药股份有限公司，国药准字：H20056422)40mg静脉滴注，第1～3 d。4周为1个疗程，连续化疗3个疗程。化疗结束后，应用放疗直线加速器(美国瓦里安公司生产)于化疗第1 d给予放疗，2 Gy/d，每周放疗5次。每周10 Gy，总剂量为60 Gy。

1.2.2自体CIK细胞免疫治疗方法：化疗第1 d同时给予自体CIK细胞免疫治疗，常规采集外周静脉血100 ml，差速离心分离单个核细胞。放入无血清培养基并于37℃孵箱中培养2 h，PBS去除未贴壁细胞，继续培养并加入购自齐鲁制药有限公司(国药准字：201612086LAB)的注射用重组人白细胞介素-11注射液(rhIL-11)和购自厦门特宝生物工程股份有限公司(国药准字：20141127、20160609)的注射用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)诱导单个核细胞CIK方向分化，加入白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子诱导CIK成熟，经形态学和分子生物标志物鉴定后持续扩大培养，回输至患者体内，隔日1次，共4次。

1.2.3免疫组化检测EGFR基因突变情况：CT引导穿刺获得肺癌组织，乙醇梯度脱水、包埋后石蜡切片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，去除内源性过氧化物酶，pH 6.0柠檬酸盐缓冲液高温高压修复并冷却至室温，羊血清封闭后滴加EGFR抗del19和mut21突变抗体(Abcam Technology, Cambridge, UK)，稀释比例1∶100，4℃孵育过夜；次日依次给予链霉素标记的羊抗兔二抗孵育15 min，链霉素标记的抗生物素孵育10 min，显微镜下DAB显色1～3 min，流水冲洗10 min，苏木素复染细胞核2 min，流水再次冲洗10 min返蓝，最终经乙醇梯度脱水和二甲苯透明后中性树胶封片，显微镜下评估EGFR突变情况。免疫组化二抗试剂盒及DAB显色液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.4基因测序法检测EGFR基因突变情况：在用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)方法检测同时，采用基因测序法检测EGFR基因突变情况。肺癌组织标本经10%福尔马林固定、石蜡包埋后切片，直接采用基因测序法检测EGFR基因是否存在基因缺失、突变情况，初次检测结果采用引物再次进行反向测序验证。基因分析仪型号为ABI 3710Genetic Analyzer(美国Applied Biosystems公司)。EGFR测序法检测相关突变的引物序列如下:del19上游引物：5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCT-3'，下游引物5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3'；mut21上游引物：5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3'，下游引物:5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'。

1.3观察指标及方法

1.3.1疗效判定：根据中国肺癌骨转移诊疗专家共识(2014版)[4]评估自体CIK细胞免疫治疗联合序贯化疗的效果，即治疗后3个月观察患者症状改善程度，癌灶大小变化。治疗有效评价标准为：癌症所致疼痛、呼吸困难等症状缓解甚至消失，肺癌及转移灶缩小，无明显不良反应和并发症。

1.3.2EGFR基因突变评价标准：EGFR基因突变免疫组化检测的阳性评价标准为细胞内出现棕黄色颗粒，评分包括阳性细胞比例评分和显色强度评分两项，二者之积即为该组织EGFR表达评分。每一份标本均由两名病理科医师经盲法评估，取平均值作为表达水平进行评分。①阳性细胞评分：<5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。②染色强度评分：阴性0分；弱阳性1分；中等2分；强阳性3分。评分≤7分视为阴性，评分≥8分视为阳性[5]。

2 结果

2.1临床疗效 91例肺癌骨转移经治疗后有效者70例，有效率达76.92%。

2.2免疫组化检测结果 EGFR基因突变阳性为细胞内出现棕黄色颗粒。见图1。治疗有效组EGFR基因的del19和mut21突变检测评分和阳性率均明显高于治疗无效组 (P<0.05)。见表1。

表1 两组表皮生长因子受体基因突变差异评分和突变阳性率比较

2.3基因测序检测结果 治疗有效组EGFR基因的del19和mut21突变检出率均明显高于治疗无效组 (P<0.05)。见表2。

表2 两组表皮生长因子受体基因突变阳性率比较[例(%)]

图1两组免疫组化检测表皮生长因子受体基因突变(SP×200)

A.有效组del19检测结果;B.有效组mut21检测结果;C.无效组del19检测结果;D.无效组mut21检测结果

3 讨论

免疫治疗是近年继手术、放疗、化疗之后第4种具有治愈恶性肿瘤疾病希望的治疗技术。因肿瘤细胞存在较强的免疫逃逸和免疫抑制功能，可有效摆脱正常免疫细胞的杀伤效应[6]。因此，通过诱导和增强机体对肿瘤细胞的免疫力，经免疫系统特异性杀伤肿瘤细胞，成为控制肿瘤生长，最终实现恶性肿瘤治愈[7]的新技术。目前，免疫治疗常用的方法主要包括免疫细胞治疗、免疫检查点特征性抑制剂、针对性抗体、溶瘤病毒、特异性癌症疫苗，其他免疫系统调节剂等，被应用于不同肿瘤的基础研究和临床试验性治疗，取得了一定的疗效[8]。

近年来，大量恶性肿瘤的免疫治疗研究发展迅速，亦成为晚期非小细胞肺癌临床治疗的热点[9]。本研究基于肺癌发病、发展的特点和原理，选择自体CIK细胞免疫治疗。CIK细胞是主要组织相容性复合物不受限的T淋巴免疫细胞，其分子表现为CD3+CD56+T阳性，具有极快的增殖和复制能力、广谱抗瘤性和强杀瘤活性[10]。人外周血单个核细胞经科学培养、针对性诱导分化成熟CIK细胞，重新回输至患者体内，可提高肿瘤细胞识别能力，并通过释放大量分子靶向毒性颗粒作用于肿瘤细胞膜，裂解肿瘤细胞导致其死亡[11]。此外，与其他自体治疗技术一致，具有免疫排斥发生率低、治疗相对安全的优势[12]。

骨转移是肺癌最常见的转移部位之一，以肋骨、胸椎、腰椎、骨盆等多见，可致患者骨骼疼痛、功能瘫痪甚至死亡。针对肺癌骨转移，常规放化疗可大规模的杀灭和抑制肺癌细胞，但残留肿瘤细胞成为日后复发、转移的重要根源或唯一根源，也是手术、放化疗治疗失败的根本原因[13-15]。故辅以CIK细胞免疫治疗，可在细胞水平针对残留的肺癌细胞继续杀灭并抑制肺癌，极大地降低了复发率、转移率，延长生存时间，并有效提高其生存质量[16-17]。本研究对全部肺癌骨转移给予自体CIK细胞免疫治疗联合序贯放化疗，有效70例，有效率达76.92%，证实该治疗临床效果确切。

EGFR是ErbB家族的一种跨膜糖蛋白，作为细胞增殖和信号传导受体，可刺激细胞生长失控、持续生长，最终发生癌变和远处转移，如骨转移、脑转移等[18-19]。目前，大量研究发现EGFR 基因突变状态是筛选非小细胞肺癌患者进行酪氨酸激酶抑制剂( TKI) 治疗最有价值的指标[20-23]。同时，检测 19 外显子 E746-A750 缺失和 21 外显子 L858R 点突变的 EGFR 基因突变特异性抗体已成为准确、快速和经济的 EGFR 基因突变筛查方法用。本研究分别采用免疫组化和qPCR法检测肺癌组织中EGFR基因突变情况，发现自体CIK细胞免疫治疗联合序贯放化疗治疗有效组EGFR基因突变检出率显著高于无效组，即del19和mut21检出率均显著高于无效组，提示EGFR基因突变的肺癌骨转移，给予该方法治疗具有更好的疗效。

综上所述，肺癌骨转移进行自体CIK细胞免疫联合序贯放化疗，疗效满意，且EGFR组织基因突变状态应用该方法疗效更好。

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