布鲁氏菌外膜蛋白Omp16的原核表达、纯化及多克隆抗体制备*

熊流新 ，黄 健 ，2，张 涛 ，李晓婷 ，徐 梅 ，陈昱希 ，陈安林 ，2，胡永林 ，2，闵 迅 ，2△（.遵义医学院检验医学院，贵州遵义563099；2.遵义医学院附属医院医学检验科，贵州遵义563003）

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患疾病。该病在临床上以长期发热、多汗、关节损害、淋巴和肝、脾大为主要症状，其病程进入慢性期则可能导致多器官不可逆损害[1]。据WHO统计，全球每年有超过50万新发病例[2]。近年来，该病发病例数及流行范围不断扩大，为世界公认危害公共卫生安全最大的传染病之一[3]。临床上主要以多西环素联合利福平或链霉素治疗为主[4]。近年来，对利福平耐药布鲁氏菌的相关报道正逐年增多，这给该病积极、有效的治疗带来严峻挑战[5]。因此，布鲁氏菌疫苗的相关研究正成为一种积极、有效的预防手段。

目前，布鲁氏菌活疫苗主要分为2类，一类是减毒光滑型疫苗，主要包括羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株、牛种布鲁氏菌S19疫苗株、猪种布鲁氏菌S2疫苗株，其含有的脂多糖（LPS）成分能刺激免疫细胞产生良好的保护作用[6]。但该类疫苗往往由于LPS O-侧链能刺激产生非特异性抗体，导致临床无法鉴别免疫接种与野生株感染。此外，其还存在较严重的毒力返祖现象，以致动物流产及播散性感染等情况的发生[7]。另一类是减毒粗糙型疫苗，主要包括牛种布鲁氏菌R型45/20和RB51。其通过反复传代减毒获得，由于该疫苗本身不含LPS O-侧链，所以不会干扰常规血清学检查[8]。但其也存在免疫保护效果差，疫苗菌株不稳定从而出现粗糙型菌株转变为光滑型菌株，并恢复强毒性等现象[9]。因此，研发免疫原性强、安全性好、价格低廉的布鲁氏菌蛋白质疫苗正成为当前的研究热点。

蛋白质疫苗具有免疫原性高、保守性好、能覆盖绝大多数血清型及生产成本低廉等诸多优点[10]。TABYNOV等[11]研究证实，将布鲁氏菌外膜蛋白Omp19制成的蛋白质疫苗诱导小鼠刺激CD4+T和CD8+T细胞产生干扰素γ（INF-γ），并且攻毒保护力能够达到牛布鲁氏菌S19疫苗株的水平。KIM等[12]研究BCSP31（布鲁氏菌31 000的外膜蛋白）、Omp3b和Cu-Zn SOD（铜-锌超氧化物歧化酶）作为蛋白质疫苗能引起强烈的Th1型免疫反应，显著提高IFN-γ及肿瘤坏死因子α（TNF-α）分泌水平，激活巨噬细胞参与的细胞免疫。这些蛋白质在所构建的动物模型中均具有不同程度的保护效应。Omp16是布鲁氏菌重要的毒力因子。研究证实，布鲁氏菌在敲除Omp16后，影响了外膜肽聚糖的连接，致使布鲁氏菌外膜结构受到破坏，最终细胞外膜通透性增加而导致细胞溶解死亡，这表明了Omp16是布鲁氏菌存活必不可少的外膜蛋白[13]。文献报道Omp16在进入小鼠体内时激活Toll样受体4（TLR4），引起TLR4自身二聚化与髓样细胞分化蛋白MyD88结合，MyD88与白细胞介素-1（IL-1）相关激酶（IRAK）结合导致IRAK自身磷酸化，激活肿瘤相关因子6（TRAF-6），使有丝分裂酶原蛋白激酶（MAPK）活化，一方面刺激依赖MAPK途径的巨噬细胞，增强其吞噬活性，使TNF-α等细胞因子上调，另一方面通过核转录因子-κB（NF-κB）激活 I-κB 家族的α、β激酶，导致I-κB磷酸化降解，最后NF-κB转到细胞核启动 IL-1、IL-6、TNF-α 转录[14]。外膜蛋白Omp16在TLR4-MyD88信息转导通路上突出的功能使其有望成为布鲁氏菌蛋白疫苗研发的一个重要靶点。

迄今为止，尚鲜见布鲁氏菌外膜蛋白Omp16重组蛋白疫苗保护效应的相关研究。因此，本课题拟通过生物信息学分析、基因克隆、蛋白质表达及纯化技术，以及多克隆抗体制备等，以期为后续的Omp16蛋白质疫苗的研发提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌E.coliBL21（DE3）、pET28a（+）质粒、E.coliDH5a 为本课题组保存；布鲁氏菌标准菌株（Brucella melitensis ATCC 23456）为遵义医学院附属医院医学检验科惠赠。

1.1.2 实验动物 BALB/c小鼠，SPF级，7周，雌性，购自中国人民解放军第三军医大学动物实验室中心。所有动物的处理按照遵义医学院伦理委员会行为准则进行。

1.1.3 主要试剂 营养琼脂粉、丙烯酰胺、考马斯亮蓝R-250、咪唑、双丙烯酰胺、Tris碱、酵母提取物、氯化钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、胰蛋白胨、溴酚蓝购于生工生物工程（上海）股份有限公司；甘氨酸、β-巯基乙醇、过硫酸铵、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、1.0 mol/L Tris-HCl（pH6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）、GoldView核酸染料、50×TAE Buffer、5%胎牛血清、HRP-羊抗鼠IgG 0.01 mol/L、磷酸盐缓冲液（PBS）粉剂 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）底物显色液、超敏电化学发光试剂盒、脱脂奶粉、PVDF膜、脱脂奶粉购于北京索莱宝公司；彩虹蛋白质Marker、DNA聚合酶（Primer Star高保真）、T4DNA连接酶、DNA Marker（DL2000、DL5000）、限制性内切酶 BamH Ⅰ/XhoⅠ购于日本TAKARA公司；基因组DNA抽提试剂盒、小量质粒DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购于北京天根公司；血平板培养基购于郑州安图绿科生物工程有限公司；96孔ELISA板购于美国康宁公司；铝佐剂（Inject Alum NO.77161）购于美国Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 Omp16蛋白生物学信息分析 利用隐马尔科夫模型和神经网络方法进行目的蛋白序列保守性预测（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）、跨膜结构预测（http：//www.cbs.dtu.dk/）、信号肽预测（http：//www.cbs.dtu.dk/）。1.2.2 引物设计 根据GenBank中布鲁氏菌的基因序列（NC_009505.1），使用 PrimerPremier 5.0设计 2种不同序列的Omp16基因引物。Omp-16-1F：CGCGGATCCATGCGCCGTATCCAGTCGATTG，Omp-16-1R：CCGCTCGAGTTACCGTCCGGCCCCGTTGA，Omp-16-2F：CGCGGATCCATGAAGAAGAACCTTCCG，Omp-16-2R：CCGCTCGAGCCGTCCGGCCCCGTTGA，标有下划线为限制性内切酶的酶切位点。本实验引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增目的基因 以细菌DNA为模板，扩增条件如下。Omp16-1：98℃变性 20 s，55℃退火 15 s，72℃延伸 45 s，30个循环，72℃延伸 5 min。Omp16-2：98℃ 变性 20 s，55℃退火 15 s，72℃延伸 42 s，30个循环，72℃延伸5 min；4℃保存。取10µL进行1%琼脂糖电泳，PCR产物经DNA回收试剂盒回收，-20℃保存。

1.2.4 构建2种不同序列布鲁氏菌Omp16的重组质粒 用限制性内切酶BamHⅠ和XholⅠ同时双酶切目的基因和质粒，使用DNA纯化试剂盒回收。将目的基因和质粒按比例混合，使用T4连接酶在PCR仪中16℃连接16 h，连接产物转入感受态细胞DH5a中，用含卡那霉素（100µg/mL）的LK平板筛选阳性克隆菌，使用质粒提取试剂盒提取质粒后，行双酶切鉴定及送生工生物工程（上海）股份有限公司测序鉴定。

1.2.5 蛋白诱导表达及纯化 将重组质粒转入E.coliBL21（DE3）中，在含有卡那霉素（100 µg/mL）的 LK 平板上，37℃培养过夜，挑取克隆阳性菌落转于10 mL含有卡那霉素（1∶1 000）的 LB 培养液中，37℃，200 r/min摇菌过夜。次日按1∶50转种含有卡那霉素（1∶1 000）的LB培养液中，将菌液摇至600 nm波长下光密度（OD）600nm值为 0.5时加入IPTG 1 mmol/L，28℃、160 r/min诱导过夜后收菌。将其用1×Binding Buffer重悬后在冰上超声破菌，将破菌后的上清液转入镍柱亲和层析柱（Ni-NTA）中，经咪唑缓冲液（20、30、40 mmol/L 咪唑，pH8.5，10 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl）充分洗脱后，用洗脱液（500 mmol/L 咪唑，pH8.5，10 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl）洗脱目的蛋白。行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白的纯度，用PBS超滤除去咪唑和NaCl，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.6 多克隆抗体制备及其效价的检测 将7周龄雌性BALB/c小鼠24只，按照随机分配原则设立实验组和空白对照组。每组免疫6只小鼠，空白对照组仅注射佐剂，实验组注射佐剂与重组蛋白按1∶1混合的蛋白悬液。免疫剂量10µg/只（首次剂量加倍），免疫途径为经皮下多点注射，每次间隔2周，共免疫3次。末次免疫后第7天，经尾静脉采集血液，分离血清放4℃冰箱备用。采用间接ELISA法检测血清抗体效价：抗原包被，将目的蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至100µg/mL，将稀释后的样品加到96孔板中，每孔100µL，4℃过夜。每孔加入牛血清白蛋白（BSA）5%封闭2 h。用空白对照组小鼠血清作阴性对照。干燥清洁条件下将BALB/c小鼠断尾采血清，将1µL小鼠血清加进封闭液100µL，按比例稀释至1×109，37℃孵育1 h。用专门PBS洗涤液洗板并吸干水。每孔加入100µL HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释）37℃孵育1 h。洗板吸干水后加入100µL TMB显色终止液显色30 min，上酶标仪前加入100µL显色终止液。将酶标仪波长设置为450 nm，检测OD值。以待测标本OD450nm（P）/Alum 佐剂（N）≥2.1 结果判断为阳性结果。

1.2.7 Western blotting检测Omp16蛋白的表达 取20µL2种不同序列的布鲁氏菌Omp16蛋白，分别加入5µL的5×SDS-PAGE上样缓冲液煮沸10 min，10 000 r/min、5 min后取5µL进行SDS-PAGE电泳。电泳后转PVDF膜，使用5%脱脂奶粉封闭2 h，用小鼠血清（1∶1 000）作为一抗4℃孵育16 h；PBST洗涤3次，加入HRP羊抗鼠 IgG（1∶5 000）作为二抗，37℃孵育 1 h，PBST 洗涤3次后使用超敏电化学发光试剂盒检测结果。

2 结 果

2.1 Omp16蛋白保守结构域预测 Omp16蛋白分子保守性较高，在61-163aa处含有1个保守结构域，命名为OmpA-C-like超家族，见图1。

图1 Omp16蛋白的保守性预测结果

2.2 Omp16蛋白跨膜结构预测 Omp16蛋白在氨基端6-28aa处可能有1个跨膜结构，见图2。

图2 Omp16蛋白跨膜结构预测结果

2.3 Omp16蛋白信号肽预测 Omp16蛋白在氨基端1-24 aa处有 1个信号肽（Y=0.570），见图3。

图3 Omp16蛋白信号肽预测结果

2.4 Omp16基因的扩增 根据以上生物信息学分析，本研究拟扩增全长及截短的Omp16基因序列Omp16-1（1-504）、Omp16-2（82-504），扩增产物经琼脂糖电泳分析显示，分别于504、423 bp处可见清晰的特异性条带，大小与预期相符（图4A），将 pET28a（+）-Omp16-1、pET28a（+）-Omp16-2重组质粒双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳，可见酶切产物与目的基因大小相符的酶切片段（图4B）。构建的质粒经生工生物工程（上海）股份有限公司分析，结果与预期一致，提示重组质粒构建成功（图5）。

图4 全长及截短表达的Omp16基因PCR扩增与重组质粒双酶切鉴定

图5 重组质粒测序峰图

2.5 重组蛋白的诱导表达及纯化 全长及截短表达的Omp16经 IPTG诱导后，在相对分子质量19.2×103、16.5×103处可见特异性蛋白条带，大小与预期相符（图6），经Ni-NTA纯化后可获得高纯度的目的蛋白。

2.6 多克隆抗体的制备和抗体效价检测 将全长及截短表达的Omp16重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，采用间接ELISA法检测血清IgG效价。实验结果显示佐剂对照组几乎不产生Omp16抗体，实验组全长及截短表达的Omp16重组蛋白的血清IgG效价高达1×107，提示Omp16重组蛋白能刺激小鼠产生较强的免疫应答（图7），Omp16-1、Omp16-2均能刺激小鼠产生高滴度的多克隆抗体（均P＜0.05），且2组间抗体滴度比较无显著变化（均P＞0.05）。

图6 全长及截短表达的Omp16重组蛋白纯化的SDS-PAGE图

图7 小鼠皮下免疫后血清IgG抗体效价检测

2.7 重组蛋白Western blotting鉴定 将纯化的全长及截短表达的布鲁氏菌Omp16重组蛋白作为抗原，小鼠抗血清作为一抗，通过Western blotting进行鉴定（图8）。结果提示2种Omp16重组蛋白均能与小鼠血清中的抗体特异性结合。

图8 重组蛋白Omp16的Western blotting鉴定

3 讨 论

蛋白质疫苗具有免疫效果好且安全性高的特点，新的保护性抗原的筛选对提高其免疫保护效果具有十分重要的意义。MALLICK等[15]研究发现，布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12在未经脂化处理时无法引起免疫保护反应，但经过脂化处理后能引起强烈的体液免疫和细胞免疫反应，产生高滴度的IgG2a，攻毒保护效果明显增加。Omp16是布鲁氏菌重要的毒力因子，属于脂蛋白[16]。Omp16在TLR4-MyD88信息转导通路上突出的功能，使其有望成为布鲁氏菌蛋白疫苗的一个重要抗原靶点。

本课题采用的原核表达是最常用的表达系统，是应用最早、最广泛的系统，简便快捷、成本低廉。但原核表达系统存在2个关键的问题：（1）异源表达的蛋白与大肠埃希菌系统不相容，蛋白无法表达；（2）表达的蛋白不可溶。影响因素包括蛋白自身的因素、载体选择、诱导剂的量、诱导时间、诱导温度等[17]。本课题组先后尝试了不同的载体，如pE-SUMO载体、pCold I载体等，但其表达产物均为包涵体形式。实验最终选用pET28a（+）载体，pET系统是目前E.coli克隆表达重组蛋白最强大的系统，当目的基因克隆到质粒时，受噬菌体T7强转录和可选择的翻译信号控制，T7 RNA酶十分高效，短时间内可使目的蛋白产量达到细菌总蛋白50%以上。本实验选用大肠埃希菌表达系统E.coliBL21（DE3），因其遗传背景清楚，能高效表达具有生物学活性的蛋白分子[18]，在实验过程中发现，Omp16-1蛋白可溶性的表达量较低，且主要以包涵体形式出现，为了获得重组蛋白Omp16的大量可溶性表达，本研究对Omp16蛋白全长进行生物学信息分析，发现这可能与其在N端1-24 aa处有1个信号肽（Y=0.570），且N端6-28 aa的位置存在1个跨膜结构密切相关。本研究通过生物学信息综合分析，成功构建了 pET28a（+）-Omp16-2 的截短表达质粒，转入E.coliBL21（DE3），经IPTG诱导后获得了大量高纯度、可溶性的目的蛋白Omp16-2，也从侧面证实了上述预测的正确性。

本研究采用全长及截短表达的重组蛋白Omp16，通过皮下多点注射的方法免疫BALB/c小鼠，结果证实Omp16-1、Omp16-2均能刺激小鼠产生高滴度的多克隆抗体（均P＜0.05），且2组间抗体滴度比较无显著变化（均P＞0.05）。Western blotting实验证实 2种 Omp16重组蛋白均能与小鼠血清中的抗体特异性结合。因此，推测Omp16的抗原表位可能位于OmpA-C-like超家族结构域。后续研究将依托制备的高纯度、高含量的重组蛋白Omp16-2，拟通过构建布鲁氏菌的黏膜或食道感染模型，通过系列主动免疫、被动保护等体内外实验，进一步验证重组蛋白Omp16在布鲁氏菌感染方面的保护效应。

[1]ROSSETTI CA，ARENAS-GAMBOA AM，MAURIZIO E，et al.Caprine brucellosis：a historically neglecteddis ease with significant impact on public health[J].PLoS Negl Trop Dis，2017，11（8）：e0005692.

[2]JIA B，ZHANG F，LU Y，et al.The clinical features of 590 patients with brucellosis in Xinjiang，China with the emphasis on the treatment of complications[J].PLoS Negl Trop Dis，2017，11（5）：e0005577.

[3]XAVIER MN，WINTER MG，SPEES AM，et al.CD4+T cell-derived IL-10 promotes Brucella abortus persistence via modulation of macrophage function[J].PLoS Pathog，2013，9（6）：e1003454.

[4]FERNÁNDEZ AG，FERRERO MC，HIELPOS MS，et al.Baldi PC.proinflammatory response of human trophoblastic cells to brucell-a abortus infection and upon interactions with infected phagocytes[J].Biol Reprod，2016，94（2）：48.

[5]ISMAYILOVA R，MODY R，ABDULLAYEV R，et al.Screening of household family membersofbrucellosis cases and neighboring community members in Azerbaijan[J].Am J Trop Med Hyg，2013，88（5）：929-931.

[6]SHELL WS，SAYED ML，SAMY AA，et al.Using real-time polymerase chain reaction as an alternative rapid method for enumeration of colony count in live Brucella vaccines[J].Vet World，2017，10（6）：610-615.

[7]DE Y，DONG C，CAO Y，et al.Genome-wide sequence transposon insertion sites andanalyze the essential genes of Brucella melitensis[J].Microb Pathog，2017，112：97-102.

[8]ZHANG J，YIN S，YI D，et al.The Brucella melitensis M5-90ΔmanB live vaccine candidate is safer than M5-90 and confers protection against wild-type challenge in BALB/c mice[J].Microb Pathog，2017，112：148-155.

[9]LALSIAMTHARA J，LEE JH.Development and trial of vaccines against Brucella[J].J Vet Sci，2017，18（1）：281-290.

[10]MENZIES PI.Vaccination programs for reproductive disorders of small ruminants[J].Anim Reprod Sci，2012，130（3/4）：162-172.

[11]TABYNOV K，YESPEMBETOV B，MATIKHAN N，et al.First evaluation of an influenza viral vector based Brucella abortus vaccine in sheep and goats：assessment of safety，immunogen-icity and protective efficacy against Brucella melitensis infection[J].Vet Microbiol，2016，197：15-20.

[12]KIM WK，MOON JY，KIM S，et al.Comparison between immunization routes of live attenuated salmonella typhimurium strains expressing BCSP31，Omp3b，and SOD of Brucella abortus in murine model[J].Front Microbiol，2016，7：550.

[13]SIDHU-MUÑOZ RS，SANCHO P，VIZCAÍNO N，et al.Brucella ovis PA mutants for outer membrane proteins Omp10，Omp19，SP41，and BepC arenot altered in their virulence and outer membrane properties[J].Vet Microbiol，2016，186：59-66.

[14]GOMES MTR，CAMPOS PC，ALMEIDA LAD，et al.The role of innate immune signals in immunity to Brucella abortus[J].Frontiers in Cellular&Infection Microbiology，2012，2（10）：130.

[15]MALLICK AI，SINGHA H，KHAN S，et al.Escheriosome-mediated delivery of recombinant ribosomal L7/L12 protein confers protection against murine brucellosis[J].Vaccine，2007，25（46）：7873-7884.

[16]TIBOR A，DECELLE B，LETESSON JJ.Outer membrane proteins Omp10，Omp16，and Omp19 of Brucella spp.Are lipoproteins[J].Infect Immun，1999，67（9）：4960-4962.

[17]TERPE K.Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production：from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems[J].Appl Microbiol Biotechnol，2006，72（2）：211-222.

[18]MIROUX B，WALKER JE.Over-production of proteins in Escherichia coli：mutant hoststhat allowsynthesis of some membraneproteins and globular proteins at high levels[J].J Mol Biol，1996，260（3）：289-298.