晋力,曾仲,刘涛
(昆明医科大学第一附属医院,昆明650000)
目前肾移植已成为治疗终末期肾病的有效手段,但术后排斥反应仍然是引起慢性肾功能不全(CRAD)的重要因素,其中急性排斥反应(AR)被认为是引起CRAD主要免疫性危险因素。microRNA(miRNA)是一类在人体内广泛分布的内源性非编码小分子单链RNA,通常由18~22个核苷酸组成。目前研究证据表明miRNA参与调控超过60%的人类编码基因[1],许多miRNA随着免疫细胞的生长和激活而发生动态变化,其在先天性及获得性免疫中均发挥重要作用[2]。研究证明,miRNA与多种疾病病理相关,如移植肾排斥反应[3]及纤维化[4]等。本研究利用高通量miRNA芯片检测技术,筛选出肾移植AR患者血浆miRNA的特异性表达谱,并采用独立样本通过RT-qPCR技术对芯片结果进行验证,以期寻找血浆中可稳定检测到的、与肾移植AR发生密切相关的miRNA,作为诊断AR的新型生物学标记物。
1.1 临床资料 选取本院器官移植科2014年3月~2015年5月首次行同种异体供肾移植术的患者26例,其中男17例、女9例,年龄19~51岁、平均32.9岁,群体反应性抗体<10%,原发性肾小球肾炎导致的慢性肾衰竭19例、糖尿病肾病6例、高血压肾小动脉硬化1例;供受体血型均相配,细胞淋巴毒试验阴性;均服用免疫抑制剂他克莫司、吗替麦考酚酯和强的松。其中AR 13例,纳入标准:出现尿量减少、血压升高、发热、体质量增加、移植肾区胀痛等临床症状;血清肌酐水平升高15%以上,尿蛋白增多,彩色多普勒提示血管阻力指数升高;移植肾活检,按Banff 97标准诊断;抗移植排斥治疗后临床症状改善。非AR 13例,纳入标准:无排斥反应症状,肌酐波动<10%,接受程序性移植肾穿刺活检,且病理结果正常。选取同期本院体检中心体检健康者10例,男6例、女4例,年龄21~45岁、平均32.7岁。AR患者、非AR患者、体检健康者年龄、性别比较差异无统计学意义(P均>0.05);均签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。
1.2 标本采集 采集研究对象空腹肘静脉血4 mL,装入涂有乙二胺四乙酸二钾的采血管中,用移液器将血液样本转移至1.5 mL的EP中,4 ℃、1 700 r/min离心10 min,取上清液置于1.5 mL的EP管中,4 ℃、2 000 r/min离心10 min,取血浆置于1.5 mL的EP管中,-80 ℃保存待用。以上过程于4 h内完成。
1.3 miRNA标记物筛选 采用微阵列芯片技术。随机选取3份AR患者及3份非AR患者的血浆,采用TRIzol法提取血浆总RNA,RNA纯度A260/A280≥1.80,表明提取的RNA中蛋白或其他有机物的污染在可接受范围内;另各样本总量≥1 μg,表明样本均满足实验要求。按照miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Agilent)试剂盒说明书进行操作,芯片扫描结果整体背景较低,信号强度较强,且信号点大小近乎均一,表明芯片杂交结果理想。用Agilent Feature Extraction(v10.7)及Agilent GeneSpring 软件提取与分析数据,检测AR与非AR患者血浆miRNA的表达谱。计算两组样品miRNA表达的差异倍数(FC),FC正值表明AR患者血浆miRNA比非AR患者表达高,负值表明AR患者血浆miRNA比非AR患者表达低。差异miRNA筛选标准:FC值>2。
1.4 miRNA临床验证 根据miRNA标记物筛选结果,选择表达显著上调的3种miRNA:miR-142-5p、miR-144-5p及miR-130a-3p作为PCR实验阶段所检测的目标miRNA。提取剩余的10份AR患者、10份非AR患者及10份体检健康者的血浆总RNA,按Qiagen公司的miRNaesy Mini Kit(Cat No./ID 217004)说明书进行操作。根据在miR Base数据库中获得的3个目标miRNA的成熟序列设计3条引物:1条通用的下游引物(GR)、1条特异性上游引物(AS)、1条特异性逆转录引物(RT)。并使用U6作为内参。miR-142-5p的3条引物分别为:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′(GR)、5′-CGGGCATAAAGTAGAAAGCAC-3′(AS)、5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACagtagt-3′ (RT);miR-144-5p的3条引物分别为:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′(GR)、5′-CGGGCGGATATCATCATATACTG-3′(AS)、5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcttaca-3′(RT);miR-130a-3p的3条引物分别为:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3(GR)、5′-CGGCAGTGCAATGTTAAAAGG-3′(AS)、5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACatgccc-3′(RT);内参U6的2条引物分别为:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(F)、5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(R)。按Thermo Fisher公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622)试剂盒说明书使用茎环法对3个目标miRNA进行逆转录,获得cDNA。以第1链cDNA为模板进行PCR扩增,扩增体系:模板1 μL、Syber Green Master 6 μL、特异性上游引物1 μL、通用的下游引物1 μL、RNase-Free water 3 μL;反应条件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,进行50~55个循环;4 ℃/s匀速升温至95 ℃后恒温15 s;4 ℃/s匀速降温至60 ℃后恒温1 min;4 ℃/s匀速升温至95 ℃后恒温15 s;在最后步骤中每升温1 ℃采集1次荧光信号绘制熔解曲线。用U6作为内参照,使用软件直接得到各样本中has-miR-142-5p、has-miR-144-5p及has-miR-130a-3p的循环数值(Ct值)。用2-ΔΔCt法计算各miRNA的相对表达量。
2.1 AR患者与非AR患者miRNA表达谱比较 AR患者与非AR患者共检测出96个差异表达的miRNA,其中13个(13.5%)表达上调(P<0.05)、7个(7.3%)表达下调(P均<0.05)。见表1。
表1 AR患者与非AR患者miRNA表达谱比较
2.2 miRNA表达谱临床验证结果 AR患者血浆miR-142-5p、miR-144-5p、miR-130a-3p相比表达量均高于非AR患者、体检健康者(P均<0.05),非AR患者、体检健康者血浆miR-142-5p、miR-144-5p、miR-130a-3p相比表达量比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。
表1 AR患者、非AR患者、体检健康者血浆miR-142-5p、miR-144-5p、miR-130a-3p表达比较
AR是影响移植肾长期存活的主要因素之一,早期诊断并及时治疗AR可有效降低移植肾的病理损害程度,并延长其存活时间。移植肾急性排斥反应诊断的金标准为肾穿刺病理检查,但为有创检查,且可能需多次穿刺才能符合AR的病理诊断标准;同时受抽样误差、病理医师水平等因素的影响,均可增加误诊风险[5,6]。因此,临床迫切需要具有高度敏感性及特异性,可稳定检测的、与肾移植AR密切相关的指标,作为诊断AR的新型生物学标记物。
近年来,研究表明miRNA与肾移植术后AR的发生密切相关。Sui等[7]通过比较3例AR患者肾活检样本与3例正常肾皮质样本之间的miRNA表达谱,发现AR组中有8种miRNA表达上调,12种miRNA表达下调。Anglicheau等[8]研究发现,AR患者有7种miRNA表达上调,10种表达下调。以上研究均采用肾脏组织作为芯片检测样本,这与从患者血液或尿液中无创检测出目标miRNA存在一定差异。Lorenzen等[3]用实时定量PCR技术,分别检测了AR组与非AR组患者尿液中miR-10a、miR-10b及miR-210的表达,结果显示AR组相比非AR组,其miR-10a表达上调,而miR-10b及miR-210表达下调。刘小友等[9]获取了12例肾移植术后发生AR患者及21例未发生AR患者的血液样本,AR组外周血中miR-223表达升高,并在术后一直维持高表达状态,且灵敏度为0.92、特异度为0.90。该研究同样检测了外周血单个核细胞在激活与非激活状态下的miR-223表达,结果显示激活组中miR-223的表达增加3.76倍。本研究通过获取被检人群的血浆作为试验样本,利用芯片及PCR技术,比较miRNA的表达。结果显示,肾移植AR组与非AR组之间共检测出96个差异表达的miRNA,其中20个miRNA表达差异显著,13个表达上调,7个表达下调。以上表达差异的miRNA可作为进一步筛选AR发生的依据。进一步采用独立样本,对芯片检测结果中表达上调的3个目标miRNA进行PCR定量检测,结果显示相比非AR组及正常对照组,AR组中miR-142-5p、miR-144-5p及miR-130a-3p的表达上调,这与芯片结果相一致。提示以上3个miRNA可能与肾移植术后AR的发生有关。
研究表明miR-142-5p不仅在肾移植AR患者的活检标本中高表达,在其他病理过程中也有高表达的情况发生,如肿瘤、免疫相关障碍、小肠炎等。Anglicheau等[8]研究认为肾移植AR患者移植肾活检组织中miR-142-5p的表达上调,可能与淋巴细胞的直接浸润相关。考虑到造血细胞系中存在的大量miR-142-5p[10,11],推测miRNA可能是由淋巴细胞携带进入异体移植物,从而影响局部炎症反应。另有研究认为,异体移植物本身可诱导发生一系列阻止排斥反应发生的调节过程,但在调节的同时仍有排斥反应在发生,可能是由于异体抗原的持续暴露[12]。
Su等[13]指出miRNA主要调节免疫细胞的功能,但其在巨噬细胞主导的纤维化中的作用还不明确;在巨噬细胞内,IL-4及IL-13共同诱导miR-142-5p及miR-130a-3p表达上调,以维持巨噬细胞的纤维化;同时指出miR-142-5p及miR-130a-3p可在慢性炎症中调控巨噬细胞纤维化相关基因的表达。本研究发现,AR患者中miR-142-5p及miR-130a-3p表达上调,推测相关miRNA可能通过提高移植肾内炎症因子的表达,增加巨噬细胞的趋化性,以影响肾移植AR微环境的炎症反应。另外,Ouyang等[14]研究发现,在三阴乳腺癌组织中miR-130a-3p及miR-451a表达下调,提示miR-130a-3p还可能与乳腺癌的发生有关。
Matsushita等[15]研究发现,在膀胱癌细胞中miR-144-5p的表达下调,并显著抑制肿瘤细胞增殖,且直接调控细胞周期调控基因CCNE1、CCNE2及CDC25A的表达。在乳腺癌患者外周血单核细胞中,miR-144-5p表达上调,miR-144-5p可作为预测乳腺癌发生的潜在非侵入性生物学标记物,但对于肾移植AR则无相关报道。
排斥反应是移植后肾功能异常的主要影响因素,从术后4 d至10年都有可能发生AR。术后5年内,在发生移植肾功能异常的受者中,AR占据了很大的比例。有统计显示,在程序性移植肾穿刺时,AR患者的肌酐水平较高,但在施加干预措施后,其肌酐水平明显下降,1年后移植肾功能丧失比例较低,相反在肾穿刺时慢性排斥反应患者的肌酐水平较低,但穿刺活检后1年移植肾功能丧失比例较高,且预后较差。以上表明,AR如能早发现、早治疗,可以逆转,且能取得良好的治疗效果。
本研究用高通量miRNA芯片检测技术,筛选肾移植AR患者血浆中miRNA的特异性表达谱;并用独立样本通过定量PCR技术验证芯片结果,发现肾移植术后患者血浆中miR-142-5p、miR-144-5p、miR-130a-3p表达上调,这可能与移植肾急性排斥反应的发生发展相关,其各自在移植肾排斥反应中的作用值得进一步研究。AR患者与非AR患者检测出差异表达的miRNA,为今后研究其在肾移植AR发生中的作用机制提供依据。
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