基于上转换荧光标记的氯噻啉免疫层析方法研究

华修德 尤红杰 杨家川 施海燕 王鸣华

(南京农业大学植物保护学院， 南京 210095)

1 引 言

氯噻啉(Imidaclothiz)是一种高效、 低毒、 广谱的新型烟碱类杀虫剂，主要作用于昆虫的烟酸乙酰胆碱酯酶受体，用于防治水稻、 小麦、 蔬菜、 烟草、 茶树、 棉花的刺吸式害虫，如小绿叶蝉、 白粉虱、 稻飞虱、 蚜虫等[1]，此外也可用于防治鳞翅目、 鞘翅目和双翅目害虫，尤其是对水稻螟虫具有很高的防效[2]。然而，大量研究证明，新烟碱类杀虫剂对蜜蜂等传粉昆虫具有高毒性[3～5]，我国国标规定了氯噻啉在农产品中的最大残留限量标准，其在糙米、 小麦、 柑橘和茶叶的最大残留限量分别为0.1、 0.2、 0.2和3.0 mg/kg[6]。因此，建立经济、 快速、 简便的氯噻啉检测方法对保障环境和食品安全具有重要的意义。

目前，氯噻啉的主要检测方法为仪器分析法，如气相色谱-质谱联用法[7]、 液相色谱法[8,9]和液相色谱-串联质谱法[10～12]。虽然仪器分析方法具有准确度高、 稳定性好等优点，但是其检测成本较高，检测设备昂贵，需要专业的操作人员，样品前处理较复杂， 且需要耗费大量的有机溶剂。免疫检测具有快速、 简便、 经济等优点，已在农药残留检测中得到了广泛的研究。已报道的氯噻啉快速检测方法包括酶联免疫分析(ELISA)[13]、 荧光偏振免疫分析(FPIA)[14]、 胶体金增强免疫层析(GICA)[15]、 量子点荧光免疫分析(QDFIA)、 时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)[16]等。虽然这些免疫检测方法可以实现氯噻啉的定性或定量检测，但是依然存在检测步骤较多和(或)检测信号易受样品基质干扰等不足。因此，有必要开发操作简单、 受样品基质干扰小的检测方法，提高免疫检测的实用性。

标记物或示踪物是免疫检测的重要的组成部分，其提供的检测信号常影响检测方法的特性。 Auzel 于1966年在研究NaYb(WO4)2钠玻璃时发现，当基质中含有Yb3+时，Er3+、 Tm3+等在近红外光激发下，可以发射出可见光，由此提出了上转换发光的概念[18]，即其激发光(长波长)的能量比发射光(短波长)的能量低，所以称之为上转换发光[18]。目前，常用的上转换荧光纳米材料(Upconversion nanoparticles，UCNPs)主要包括Gd2O3∶Yb, Er、 NaGdF4∶ Yb,Er、 NaYF4∶Yb,Tm、 Y2O3∶Yb,Er等。UCNPs是一种新型荧光材料，具有化学稳定性好、 发光强度高、 毒性小、 Stokes位移大、 发射光谱窄、 不易发生光漂白等优点，并且由于使用了难以被样品基质所吸收的近红外光为激发光源，消除了背景荧光的干扰，提高了信噪比和检测灵敏度。目前，UCNPs作为标记物已被用于氟喹诺酮类药物[19]、 磺胺喹噁啉[20]、 黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A[21]等的定量检测。本研究组前期工作中，以UCNPs为标记物建立基于内滤效应(Inner filter effect，IFE)的竞争免疫分析方法，并用于检测环境和农产品中的氯噻啉，结果表明，UCNPs作为示踪物可有效的降低田水、 土壤、 梨、 大米、 苹果、 番茄、 青菜和甘蓝等样品基质的干扰[22]。

本研究采用氯噻啉单克隆抗体标记的NaYF4∶Yb,Er UCNPs作为荧光标记物，制备了上转换荧光免疫层析(Upconversion immunochromatographic assay，UICA)试纸条，优化实验条件(UCNPs标记物的浓度、 检测线(Test line，T-L)上的包被原浓度、 控制线(Control line，C-L)上的羊抗鼠IgG浓度、 检测溶液的pH值、 离子强度、 甲醇含量、 检测时间等)，建立了UICA的标准曲线，在田水、 土壤、 桃、 梨、 黄瓜、 番茄、 小麦、 大米等基质中进行了添加回收实验，并使用高效液相色谱法对UICA的实际样品检测结果进行了验证。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

XYZ-3000三维喷条仪、 CM4000 切条仪(美国BioDot公司); F-2700荧光分光光度计(日本日立公司); 980 nm 激光器(长春镭射光电科技有限公司); 各种规格的单通道移液器(德国Eppendorf公司); Agilent 1260 HPLC仪(美国Agilent公司); H-7650透射电镜(TEM, 日本日立公司); Zetasizer Nano 纳米粒度电位仪(英国Malvern公司); 5418R台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司); MUL9000(A)-30纯水系统(南京总馨纯水设备有限公司); FW135粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司); JS31-300多功能搅拌机(浙江绍兴苏泊尔生活电器有限公司)。

氯噻啉(97.0%，南通江山农药股份有限公司); 其它烟碱类农药标准品(江苏农药研究所有限公司); 羊抗鼠IgG(美国Sigma公司); 牛血清蛋白(BSA，98.0%，北京索莱宝科学与技术有限公司); 硝酸纤维素(Nitrocellulose，NC)膜(Millipore135)、 玻璃纤维垫、 样品垫和吸水垫(美国Millipore公司); 氯噻啉单克隆抗体(1E7)和包被抗原由实验室自制[13]; 氨基功能化的NaYF4∶Yb,Er UCNPs由实验室自制[22]; 其它试剂均为分析纯。

2.2 氯噻啉单克隆抗体与UCNPs的偶联

采用经典的戊二醛交联法将氯噻啉抗体与氨基功能化的NaYF4∶Yb,Er UCNPs偶联[23,24]。称取10 mg氨基功能化的UCNPs于2.5 mL 0.01 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 8.0)中，超声分散15 min。加入0.64 mL 25% 戊二醛溶液和50 mg NaBH4，室温下缓慢振荡1 h。反应结束后，用上述硼酸盐缓冲溶液洗涤3次，离心，除去上清液。加入3 mL硼酸盐缓冲液重新分散沉淀，加入0.6 mL 1 mg/mL氯噻啉抗体和50 mg NaBH4，室温下缓慢振荡1 h，加入50 mg Tris作为封闭剂，继续缓慢振荡1 h。反应结束后离心分离，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，移去上层溶液，用5 mL硼酸盐缓冲液分散沉淀，即得到标记氯噻啉单克隆抗体的UCNPs标记物。

2.3 UICA试纸条的组装及检测

UICA试纸条上所用试剂均使用XYZ-3000三维喷条仪进行喷涂。氯噻啉单克隆抗体标记的UCNPs均匀地喷涂在结合垫上，37℃干燥3 h。氯噻啉人工抗原和羊抗鼠IgG分别喷涂在NC膜的左侧和右侧，相距5 mm，作为T-L和C-L，37℃干燥2 h。将NC膜粘贴于聚氯乙烯粘性底板中间的位置; 结合垫粘贴于NC膜的左侧，与NC膜重叠1 mm; 吸水垫粘贴于NC膜的右侧，与NC膜重叠1 mm; 样品垫粘贴于结合垫的左侧，与其重叠2 mm。组装好后整个底板用切条仪切成4.08 mm宽的试纸条，干燥条件下常温保存待用(图1)。

将待测样品溶液加到试纸条的样品垫，样品液会因毛细作用沿试纸条向右侧移动。当样品溶液移动到结合垫时，结合垫上的UCNPs标记物会分散在样品液中，并随样品液继续向前移动。到达T-L后，样品溶液中的氯噻啉将与T-L上的包被抗原竞争结合UCNPs标记物上的抗体，氯噻啉的浓度越高，T-L的荧光强度越弱。未被T-L结合的UCNPs标记物继续移动到C-L后与C-L上的羊抗鼠IgG结合，使C-L产生荧光，表明检测结果有效; 若C-L未产生荧光，表明检测结果无效。加样25 min后，使用外接980 nm激光光源的荧光分光光度计对试纸条T-L在544 nm处的荧光强度进行测定。以UICA试纸条T-L荧光强度变化值(ΔI=I-I0， 其中，I为有分析物时T-L在544 nm的荧光强度;I0为无分析物时T-L在544 nm的荧光强度，即阴性对照的荧光强度。)为纵坐标，氯噻啉浓度对数为横坐标绘制校正曲线，获得线性方程，计算出抑制中浓度(Half-maximal inhibition concentration，IC50)、 检出限(IC10)和线性范围(IC10～IC90)。

图1 上转换荧光免疫层析(UICA)试纸条示意图Fig.1 Schematic diagram of upconversion immunochromatographic assay (UICA) strip

2.4 条件优化

2.4.1试纸条参数优化用生理盐水配制系列稀释倍数的氯噻啉包被抗原，将其喷涂在NC膜上作为T-L，分别建立不同T-L稀释倍数下的标准曲线，选择I0与IC50比值(I0/IC50)最大的稀释倍数作为最佳稀释倍数。在确定T-L上氯噻啉包被抗原的用量后，优化UCNPs标记物的用量。选择检测阴性样品时，T-L荧光强度不再明显增强时对应的UCNPs标记物用量为其最佳用量。设置系列C-L上羊抗鼠IgG的喷涂浓度，选择检测阴性样品时，C-L和T-L荧光强度相近的浓度作为其最佳浓度。

2.4.2工作条件的优化对检测缓冲液的pH值(5.0、 6.0、 7.4、 8.0、 9.0和10.0)、 NaCl浓度(0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5和0.6 mol/L)、 甲醇含量(0、 2.5%、 5%和10%)、 PEG20000含量(0、 0.05%、 0.1%、 0.2%、 0.4%和0.8%)及检测时间(5、 10 、 15、 20、 25、 30和35 min)进行优化。在上述的检测缓冲液下建立标准曲线，选择I0/IC50最大值对应的条件为最优条件。检测时间选择检测阴性样品时荧光强度达到最大值所需的最短时间。

2.5 特异性评价

在最优条件下，使用UICA对氯噻啉结构类似物的标准溶液进行检测，建立各类似物的标准曲线，并计算IC50，根据公式(交叉反应率(Cross-reactivity，CR)= IC50(氯噻啉)/IC50(氯噻啉结构类似物)×100)计算CR，并评价UICA的特异性。

2.6 添加回收实验

量取10 mL过滤后的田水空白样品，添加氯噻啉标准溶液使其浓度分别为80、 200和500 ng/mL; 称取10 g粉碎后的土壤、 桃、 梨、 黄瓜、 番茄、 小麦、 大米空白样品(其中土壤碾碎处理; 桃、 梨、 黄瓜、 番茄用榨汁机匀浆处理; 小麦、 大米用粉碎机粉碎处理)于三角瓶中，使氯噻啉添加浓度为200～5000 ng/g， 所有样品混匀后静置过夜。田水样品稀释后直接检测。固体样品：加入50 mL乙腈和5 mL水， 振荡提取1 h，抽滤至加有5 g NaCl的具塞量筒中，剧烈振荡30 s，静置30 min，上层有机相过无水Na2SO4于平底烧瓶中，用乙腈对无水Na2SO4硫酸钠淋洗一次，合并有机相，真空旋转蒸发至近干，用最优缓冲溶液定容至10 mL，适当稀释后进行检测。每个添加浓度重复3次，计算回收率和相对标准偏差。

2.7 方法验证

采集喷洒过10%氯噻啉可湿性粉剂的田水和梨样品，分别使用UICA和HPLC进行检测，并对其结果进行相关性分析。UICA的样品前处理和检测参照添加回收实验。

HPLC法[22]：梨样品(20 g)用50 mL乙腈和5 mL水振荡提取1 h，抽滤后加入5 g NaCl进行分层，有机相过无水Na2SO4后真空旋转蒸发至近干; 田水样品加5 g NaCl后用30 mL乙腈萃取2次，合并有机相后过无水Na2SO4，真空旋转蒸发至近干。使用2 mL甲醇-水(30∶70，V/V)定容后进行检测。仪器条件：色谱柱为Eclipse pluse-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(30∶70，V/V)，柱温30℃，检测波长为270 nm，流速0.9 mL/min，进样量为20 μL。

3 结果与讨论

3.1 氯噻啉单克隆抗体与UCNPs偶联物的鉴定

用纳米粒度电位仪和TEM仪对氨基功能化UCNPs和氯噻啉抗体与UCNPs偶联物的粒径和形态进行鉴定。UCNPs在标记前和标记后的平均粒径分别为82.5和86.7 nm，标记后的平均粒径略大。标记后的UCNPs在形态上发生了明显的变化，氨基功能化的UCNPs表面光滑，而抗体标记后的UCNPs表面粗糙(图2)。通过TEM的结果可以初步确定UCNPs的表面已标记上氯噻啉单克隆抗体。

图2 氨基功能化上转换荧光纳米材料(UCNPs)(A)和抗体与UCNPs偶联物(B)的透射电镜图(TEM)Fig.2 Transmission electron microscope (TEM) images of amino-modified upconversion nanoparticles (UCNPs) (A) and the conjugation of antibody and UCNPs (B)

3.2 条件优化

3.2.1试纸条参数当包被抗原的浓度稀释至40倍时，I0/IC50达到最大值，其对应的包被抗原浓度为0.195 mg/mL，喷涂量为1 μL/cm(图3A)。如图3B所示，随着UCNPs浓度的逐渐增加，荧光强度逐渐增强，当T-L上人工抗原结合的UCNPs标记物达到饱和后，T-L的荧光强度不再继续增加，此时对应的UCNPs标记物浓度为3 mg/mL，喷涂量为3 μL/cm。当羊抗鼠IgG浓度为0.15 mg/mL，喷涂量为1 μL/cm时， C-L的荧光强度与T-L接近。

图3 (A)包被抗原浓度对上转换荧光免疫层析敏感性的影响; (B)上转换荧光纳米材料(UCNPs)标记物浓度对检测线(T-L)荧光强度的影响Fig.3 (A) Effect of coating antigen concentration on the sensitivity of UICA; (B) effect of concentration of conjugated UCNPs on fluorescence intensity of test line (T-L)

3.2.2试纸条工作条件在实验设置的系列pH值、 离子强度和PEG20000含量的条件下，I0/IC50值都先升高再降低(图4A～4C)，最优条件为pH=8.0、 0.3 mol/L NaCl、 0.2% PEG20000。在测试的系列甲醇含量的缓冲溶液中，I0/IC50值随着甲醇含量的升高而降低，在不含甲醇时，I0/IC50值达到最大(图4D)。但是，甲醇作为助溶剂，在标准溶液配制和样品前处理中均被使用，为减少甲醇对检测敏感性的降低，选择添加2.5%甲醇。在检测溶液加到样品垫后的5～25 min内，T-L的荧光强度逐渐增强； 25 min后，T-L的荧光强度趋于稳定，最佳检测时间为25 min(图4E)。

图4 上转换荧光免疫层析工作条件的优化：(A)pH值; (B)钠离子浓度; (C)PEG20000浓度; (D)甲醇浓度; (E)检测时间Fig.4 Optimization of working conditions for UICA: (A) pH values; (B) concentration of Na+; (C) concentration of PEG20000; (D) concentration of methanol; (E) detection time

3.3 灵敏度

在最优条件下，UICA对氯噻啉标准品的检测结果如图5A所示，氯噻啉浓度从1 ng/mL增大到4000 ng/mL时，其荧光光谱的强度逐渐降低。对544 nm处的荧光强度进行线性拟合后获得校正曲线和线性方程(图5B)，计算的IC50为97.21 ng/mL，线性范围(IC10～IC90)为26.30～363.08 ng/mL，最低检出限(IC10)为26.30 ng/mL。将UICA与已发表的免疫检测方法进行比较(表1)，UICA的敏感性低于QDFIA、 TRFIA和IFE，与ELISA和FPIA相似。但UICA的IC50和最低检出限均低于国家规定的最低限量标准(0.1 mg/kg)[23]，可以满足氯噻啉残留检测的要求。此外，UICA的检测步骤比ELISA、 QDFIA和TRFIA简便; 检测时间比ELISA、 QDFIA、 TRFIA和IFE短; 示踪物比ELISA、 FPIA、 GICA、 QDFIA和TRFIA抗样品基质干扰能力强。

3.4 特异性

UICA对氯噻啉类似物标准溶液的检测结果如表2所示。UICA除对吡虫啉有较高的CR(95.72%)外，对其它结构类似物的CR可忽略不计。该结果与其它基于相同氯噻啉单克隆抗体建立的免疫分析方法[13～16,22]的结果一致，其原因是免疫分析方法的特异性主要由抗体的特性决定。由于氯噻啉和吡虫啉结构相似，以氯噻啉或者吡虫啉半抗原制备的抗体常对两种农药均可识别，建立的检测方法也存在交叉反应。

图5 (A)检测线(T-L)在系列浓度的氯噻啉标准品溶液下的荧光强度; (B)氯噻啉UICA校正曲线Fig.5 (A) Fluorescence intensity of test line (T-L) with serial concentrations of imidaclothiz standard solutions; (B) calibration curve of imidaclothiz by UICA

表1 氯噻啉免疫分析方法的比较

Table 1 Comparison of immunoassay methods for imidaclothiz

方法Method示踪物TracerIC50或SC50a∗IC50orSC50(ng/mL)检测时间Detectiontime(min)检测步骤Detectionstep参考文献ReferenceELISA辣根过氧化物酶Horseradishperoxidase87．50>1656[13]FPIA异硫氰酸荧光素Fluoresceinisothiocyanate87．94111[14]GICA胶体金Colloidalgold25．00∗∗101[15]QDFIA量子点Quantumdots20．412103[16]TRFIA铕离子Europiumion6．912154[16]IFE上转换荧光纳米材料UCNPs18．90501[22]UICA上转换荧光纳米材料UCNPs97．21251本研究Thisstudy∗：饱和中浓度；∗∗：定性检测，未计算IC50，检出限为25ng/mL。∗：Theconcentrationofanalyteproducinga50%saturationofthesignal(SC50)；∗∗：Qualitativetest，didnotcalculateIC50，thedetectionlimitwas25ng/mL．ELISA，Enzyme⁃linkedimmunosorbentassay；FPIA，Fluorescencepolarizationimmunoassay；GICA，Goldimmunochroma⁃tographicassay；QDFIA，Quantumdots⁃basedfluoroimmunoassay；TRFIA，Time⁃resolvedfluoroimmunoassay；IFE，innerfiltereffect

3.5 准确度

在样品检测前需去除样品基质的影响，使用缓冲液对样品基质进行稀释是免疫检测最常用、 最简便的降低基质干扰的方法。使用缓冲液对8种样品的空白基质进行系列稀释后建立各自的标准曲线，并与缓冲液标准曲线进行对比，选择与缓冲液标准曲线相似的最低稀释倍数。结果表明， 田水样品稀释2倍; 土壤、 梨、 桃和小麦样品提取液稀释5倍，黄瓜和番茄样品提取液稀释10倍，大米样品提取液稀释20倍后的标准曲线与缓冲液标准曲线相似，即基质影响已被去除或可忽略不计。

在相应的稀释倍数下，UICA对田水、 土壤、 梨、 桃、 小麦、 黄瓜、 番茄、 大米添加样品的检测结果如表3所示。平均添加回收率为71.8%～97.2%，相对标准偏差为0.7%～10.7%。表明本方法准确度较好，能够满足环境样品和农产品中氯噻啉残留的定量检测的要求。

3.6 实际样品分析

UICA对田水和梨实际样品的检测结果表明， 田水样品中氯噻啉的含量在70.5～685.9 ng/mL之间，梨样品中氯噻啉的含量在176～1468.5 ng/g之间。UICA的检测结果与HPLC的结果(田水： 84.2～655.2 ng/mL; 梨： 124.1～1463.1 ng/g)接近。两种方法检测结果的相关性如图6所示，相关性方程为y=1.0575x-22.7513，R2=0.9797，其斜率≈1，说明具有较高的相关性。结果表明，UICA的检测结果准确、 可靠，可用于实际样品中氯噻啉残留的定量检测。

表2 上转换荧光免疫层析对氯噻啉结构类似物的交叉反应

Table 2 Cross-reactivity of analogues structurally related to imidaclothiz toward its analogues determined by UICA

化合物Compound化学结构式Chemicalstructure抑制中浓度IC50(ng/mL)交叉反应率CR(%)氯噻啉Imidaclothiz97．37100吡虫啉Imidacloprid101．7295．7噻虫嗪ThiamethoxamNNN—NO2SClOH3C—N>100000<0．1烯啶虫胺Nitenpyram>100000<0．1噻虫啉Thiacloprid6555．071．5啶虫脒Acetamiprid2226．214．4呋虫胺Dinotefuran>100000<0．1

表3 上转换荧光免疫层析对氯噻啉添加样品的平均回收率

Table 3 Average recoveries of samples spiked with imidaclothiz by UICA (n=3)

样品Sample添加浓度Spiked(ng/gorng/mL)实测浓度Measured(ng/gorng/mL)平均回收率Recovery(%)相对标准偏差Relativestandarddeviation(RSD，%)田水Paddywater土壤Soil梨Pear桃Peach小麦Wheat黄瓜Cucumber8065．8±3．482．25．2200176．4±11．588．26．5500421．6±24．184．35．7200154．7±4．877．43．1500455．7±4．781．01．01000809．5±20．695．32．6200157．4±9．878．76．2500362．4±5．772．51．61000823．7±48．582．45．9200170．6±12．085．37．0500413．2±9．482．62．31000972．5±12．097．21．2200169．5±5．484．73．2500406．4±12．681．33．11000932．2±6．793．20．7200143．5±7．871．85．4500426．2±8．185．21．21000817．3±12．181．71．5

续表3(Continued to Table 3)

样品Sample添加浓度Spiked(ng/gorng/mL)实测浓度Measured(ng/gorng/mL)平均回收率Recovery(%)相对标准偏差Relativestandarddeviation(RSD，%)番茄Tomato大米Rice500373．2±16．974．64．51000806．6±16．880．72．120001661．7±76．183．14．6800648．3±20．981．03．220001612．8±32．980．62．050003688．1±395．673．810．7

图6 UICA与HPLC对氯噻啉实际样品检测结果的相关性分析Fig.6 Correlation between results by UICA and HPLC for authentic samples of imidaclothiz

4 结 论

本研究建立了一种基于NaYF4∶Yb,Er UCNPs的UICA，并将其用于环境样品和农产品中氯噻啉的定量检测。此检测方法结合了UCNPs和ICA的优点，具有操作简单、 检测时间短和抗样品基质干扰能力强等优点。经条件优化后，其抑制中浓度(IC50)为97.37 ng/mL，检出限(IC10)为26.30 ng/mL，线性范围(IC10～IC90)为26.30～363.08 ng/mL。UICA对田水、 土壤、 梨、 桃、 小麦、 黄瓜、 番茄、 大米等添加样品的平均添加回收率为71.8%～97.2%，对实际样品的检测结果与HPLC法相符，且具有较高的相关性。结果表明，本检测方法可作为环境样品和农产品中氯噻啉残留的定量检测工具。如果能够研发出便携式上转换荧光检测设备，UICA将可实现现场、 快速的定量检测，从而对保障环境和食品安全起到更好的促进作用。

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