葛根素对脑外伤大鼠神经保护作用及对p38MAPK通路和GLT-1表达的影响*

胡古秀 李 阳 吴 华

（安徽省合肥市滨湖医院，安徽 合肥 230061）

脑外伤（TBI）是神经外科疾病之一［1］，由于其发病位置的特殊性，严重的TBI会使脑内神经受到损伤，同时，TBI还会引发多种并发症和继发障碍，如癫痫、脑积水、内分泌功能障碍、中枢性尿崩症等，严重影响患者的身体健康和生命安全［2］。TBI引起的氧化应激反应和炎症损伤是造成患者死亡的主要原因，因此探寻能够减弱炎症反应的药物是治疗TBI的关键［3］。葛根素（Pue）是一种天然的抗氧化剂，具有对抗免疫、扩张血管、降低血液黏度、改善微循环等作用，因此，不少学者将葛根素应用于TBI的治疗中［4-5］。本研究以建立的葛根素大鼠模型为研究对象，探究葛根素对TBI大鼠神经的保护作用，及潜在的分子机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠70只，SPF级，8～10 周龄，体质量（150±20） g，购自中国农业大学，许可证号：SYXK（京）2015-0045。

1.2 试药与仪器 葛根素（山东省莱阳生物化学制药厂，批号：130752-201815）；纳洛酮（北京市永康药业有限公司，批号：160627）；RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自宝生物（大连）有限公司；TaqDNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；兔抗鼠LC3-Ⅱ、p38MAPK、p-p38MAPK和GLT-1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；3K15超低温离心机购自德国Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD双人净化工作台购自苏州苏净；引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 造模与分组 按照文献资料，将大鼠称体质量，按1 mL/100 g腹腔注射4%水合氯醛进行麻醉，头部剪毛消毒后固定于脑立体定位仪上，于头皮正中切开，剥离右侧颅顶骨膜，用颅骨钻刺一4 mm的骨窗，剥开硬脑膜，在脑表面放置直径为3 mm的垫片，从20 cm高度落下40 g的祛码撞击垫片，建立TBI模型［6］。假手术组仅切开头皮、左顶部开骨窗，不致TBI，模型组和假手术组均用牙科水泥固定骨孔处，待完全干燥后缝合头皮，然后将大鼠放回饲养笼内继续饲养48 h（排除手术和麻醉干扰），将大鼠脱颈椎处死，取出全脑，在体视显微镜下去除脑膜及血管后，记录脑组织湿重（g），置于红外线干燥箱将脑组织烘干至恒重，记录其干重（g），计算6组大鼠脑组织含水量，含水量＝（湿重-干重）/湿重×100%。动物分组，将造模成功的大鼠随机分成5组，每组10只，分别命名为模型组、纳洛酮组、葛根素低剂量组、P葛根素中剂量组、葛根素高剂量组，纳洛酮组给予0.4 mg/kg纳洛酮，葛根素组按低、中、 高剂量分别给予 20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg，所有大鼠均行灌胃治疗，假手术组及模型组给予等量生理盐水，持续治疗2周。

1.4 标本采集与检测 按照造模方法将大鼠麻醉，用75%酒精消毒2～3 min，在无菌的超净台剪开大鼠胸腔，暴露心脏，用4%多聚甲醛灌注固定，直至肝脏变白、四肢僵硬，断头后用剪刀剪开头皮及颅骨，取出全脑，在体视显微镜下去除脑膜及血管后，置于-80℃冰箱保存备用。1）大鼠皮质神经元存活率检测。用冰冻切片机制作大脑皮层组织切成（不超过5 μm），室温干燥后，用PBS（pH7.2左右）漂洗2～3次，干燥后用1%甲苯胺蓝染色20 min，水洗后放入0.5%盐酸乙醇溶液中分化，经梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明（25 min），以中性树胶封片。置于光镜下观察损伤灶周围神经元形态及计录存活神经元数量。皮质神经元存活率＝损伤侧神经元计数值/正常侧神经元计数值×100%。2）qRT-PCR检测大鼠脑组织中LC3-Ⅱ mRNA表达水平。用RNA提取试剂盒提取6组大鼠脑组织总RNA，用反转录试剂盒将其反转成cDNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。根据LC3-Ⅱ的cDNA序列设计引物，上游引物 F1：5′-GAACAAAGAGTGGAAGATG-3′。下游引物 R1：5′-GCCGTCTGATTATCTTGA-3′，GAPDH：上游引物 F：5′-CGTTGGCTT CCCAGAACATCAT-3′。下游引物 R：5′-CATCGGACACATTGGGGGTAG-3′。以GAPDH为内参进行qRT-PCR。PCR的反应体系为：5×缓冲液 10 μL，TaqDNA 聚合酶 1 μL， 上游引物 F 2 μL，下游引物 R 2 μL，10 mM dNTP mix 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 33 μL；PCR 的反应条件为：预变性 95 ℃5 min，变性95℃ 30 s，延伸59℃ 15 s（LC3-Ⅱ和GAPDH），40个循环，延伸时读取光密度（D）值。采用最大二阶导数法（2-△△Ct）对数据进行统计，计算 LC3-ⅡmRNA的相对表达量。3）免疫荧光染色检测大鼠脑组织中LC3-Ⅱ蛋白的表达水平。取分离的脑组织，用10%甲醛溶液固定后，取出损伤部位组织制作切片（厚度不超过10 μm），将组织切片在92～98℃条件下存放20 min进行抗原修复，滴加正常山羊血清用来中和非特异性反应后，在组织玻片上滴加1∶200稀释的兔抗鼠LC3-Ⅱ多克隆抗体，于4℃过夜放置，复温后再组织玻片上滴加FITC二抗，于避光条件下室温孵育1 h，用甘油封片后，于激光共聚焦扫描显微镜下观察6组大鼠脑损伤组织中LC3-Ⅱ的表达情况，并采集照片（400 倍）。 4）Western blot检测 p38MAPK、p-p38MAPK和谷氨酸转运体-1（GLT-1）表达水平。分别向6组大鼠脑损伤组织中加入2 mL细胞裂解液，提取总蛋白，以GAPDH为内参，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），每孔上样体积 20 μL，电泳结束后，半干转膜仪转膜50 min，分别滴加兔抗鼠p38MAPK、pp38MAPK和GLT-1多克隆抗体，置于4℃下过夜，滴加二抗37℃放置1 h。加入ECL发光剂进行显影，利用自动凝胶成像系统采集图像，并利用Gel-Pro analyzer4软件对SDS-PAGE电泳图目的条带进行扫描，分析p38MAPK、p-p38MAPK和GLT-1表达水平。

1.5 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脑外伤模型的鉴定 见表1。模型组大鼠脑组织中的含水量显著高于假手术组（P＜0.05），结果提示脑外伤大鼠模型构建成功。

表1 脑组织含水量的测定（±s）

表1 脑组织含水量的测定（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05。

组 别 n 脑组织含水量（%）假手术组 1071.32±8.67模型组 1090.64±9.37*

2.2 甲苯胺蓝染色检测皮质神经元存活率 见表2。模型组大鼠的皮质神经元存活率显著低于假手术组（P＜0.05）；纳洛酮组和葛根素各剂量组大鼠的皮质神经元存活率显著高于模型组（P＜0.05）；且随着葛根素剂量的增加，皮质神经元存活率显著提高（P＜0.05），呈剂量依赖性。

表2 甲苯胺蓝染色检测皮质神经元存活率（%，±s）

表2 甲苯胺蓝染色检测皮质神经元存活率（%，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与纳洛酮组比较，#P＜0.05；与 Pue低剂量组比较，◇P＜0.05；与 Pue中剂量组比较，&P＜0.05。

组 别 n假手术组 10模型组 10纳洛酮组 10皮质神经元存活率87.24±9.34 19.64±9.21*43.27±8.79*△葛根素低剂量组 10 28.13±12.26*△葛根素中剂量组 10 56.13±9.12*△#◇葛根素高剂量组 10 72.11±11.09*△#◇&

2.3 qRT-PCR检测脑组织中LC3-ⅡmRNA表达水平 见表3。模型组大鼠脑组织中LC3-ⅡmRNA表达水平显著高于假手术组（P＜0.05）；纳洛酮组和葛根素各剂量组大鼠脑组织中LC3-Ⅱ mRNA表达水平显著低于模型组（P＜0.05）；且随着葛根素剂量的增加，LC3-Ⅱ mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），呈剂量依赖性。

表3 qRT-PCR检测脑组织中LC3-ⅡmRNA表达情况（±s）

表3 qRT-PCR检测脑组织中LC3-ⅡmRNA表达情况（±s）

组 别 n假手术组 10模型组 10纳洛酮组 10 LC3-ⅡmRNA 0.16±0.07 0.98±0.21*0.75±0.07*△葛根素低剂量组 10 0.61±0.11*△葛根素中剂量组 10 0.59±0.12*△#◇葛根素高剂量组 10 0.42±0.11*△#◇&

2.4 免疫荧光染色检测脑组织中LC3-Ⅱ蛋白表达水平 见图1。模型组大鼠脑组织中LC3-Ⅱ蛋白的表达水平高于假手术组；纳洛酮组和葛根素组大鼠脑组织中LC3-Ⅱ蛋白的表达水平低于模型组；且随着葛根素剂量的增加，LC3-Ⅱ蛋白的表达水平降低，呈剂量依赖性。

图1 免疫荧光染色检测脑组织中LC3-Ⅱ蛋白的表达水平（400倍）

2.5 Western blot检测脑组织中p38MAPK、p-p38MAPK和GLT-1表达水平 见图2，表4。各组间大鼠脑组织中p38MAPK的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组大鼠脑组织中p-p38MAPK表达水平显著高于假手术组（P＜0.05）；纳洛酮组和葛根素各剂量组大鼠脑组织中p-p38MAPK表达水平显著低于模型组 （P＜0.05）；且随着葛根素剂量的增加，p-p38MAPK表达水平显著降低（P＜0.05），呈剂量依赖性。模型组大鼠脑组织中GLT-1表达水平显著低于假手术组（P＜0.05）；纳洛酮组和葛根素各课题组大鼠脑组织中GLT-1表达水平显著高于模型组（P＜0.05）；且随着葛根素剂量的增加，GLT-1表达水平显著升高（P＜0.05），呈剂量依赖性。

图2 Western blot检测脑组织中p38MAPK、p-p38MAPK和GLT-1表达水平

表4 各组脑组织中38MAPK、p-p38MAPK、GLT-1的相对表达水平比较（±s）

表4 各组脑组织中38MAPK、p-p38MAPK、GLT-1的相对表达水平比较（±s）

组别 n假手术组 10模型组 10纳洛酮组 10葛根素低剂量组 10葛根素中剂量组 10葛根素高剂量组 10 p38MAPK 0.78±0.23 0.75±0.24 0.77±0.22 0.74±0.20 0.78±0.25◇0.77±0.26◇&p-p38MAPK GLT-1 0.54±0.21 1.18±0.17 1.18±0.35* 0.51±0.11*1.07±0.32*△ 0.80±0.09*△1.02±0.27*△# 0.63±0.10*△#0.85±0.28*△#◇ 0.65±0.11*△#◇0.76±0.27*△#◇& 0.94±0.16*△#◇&

3 讨 论

TBI会引起严重的神经损伤和炎症反应，轻则影响患者的认知功能和肢体运动，重则威胁患者的生命安全。现代医学对TBI的具体发生发展机制仍处于探讨阶段，而中医学对该病的病因病机有一定的理论分析［7］。中医学认为，TBI归于中医外伤的范畴，脑部因暴力所伤，导致血络受损，血溢于外，气血亏虚，血不循经，瘀血阻滞，其临床症状主要表现为脑水肿、脑积水和脑内神经受损［8-10］。基于此理论，本研究采用祛码撞击的方法建立TBI大鼠模型，并检测脑组织含水量，结果表明模型组大鼠脑组织中的含水量显著高于假手术组，提示脑外伤大鼠模型构建成功。

TBI的病理特点是本虚标实，以气血亏虚为本，血瘀痰火为标。因此TBI的治疗应以活血化瘀，补气养血、益肾填精为主［8］。纳洛酮是一种非专一性阿片受体竞争性拮抗剂，能够抑制血管收缩增加血流量，减轻炎症反应，但是不能从根本上解决脑外伤后的神经损伤。葛根素是从豆科植物葛根中提取的天然活性物质，其主要有效成分是黄酮类。近年来，不少学者将葛根素应用于TBI的治疗中。赵海臣等研究表明，葛根素注射液能够明显改善TBI患者临床症状，疗效显著［11］。李国亮等研究表明，葛根素可以减轻颅脑水肿、并通过抑制氧化应激反应及炎症反应进而发挥对神经的保护作用［5］。还有研究表明，葛根素可以调节大鼠颅脑损伤后ICAM-1和NF-κB的表达，进而发挥对脑组织的保护作用［12］。在脑外伤中自噬与脑组织和神经损伤密切相关，LC3是一种自噬相关蛋白，有Ⅰ型和Ⅱ型之分，未发生自噬时主要以LC3-Ⅰ的形式存在，当自噬发生时LC3-Ⅰ经泛素化修饰形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是判断自噬活性的重要分子标记物［13-14］。本研究表明，葛根素能够提高TBI大鼠皮质神经元的存活率，且随着葛根素剂量的增加，皮质神经元的存活效率显著增加；同时，葛根素能够降低大脑皮层中神经元自噬相关基因LC3-Ⅱ表达水平，且随着Pue剂量的增加，LC3-Ⅱ的表达水平显著降低，提示Pue对脑外伤大鼠神经具有保护作用。

p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路能够参与生物体多种生命活动，近年来不少学者表明，p38MAPK与脑外伤后神经元自噬和神经损伤密切相关。徐小涵等研究表明，葛根素通过下调体外培养海马神经元中p38MAPK的表达水平，进而减弱海马神经元凋亡［15］。除此之外，p38MAPK通路在自噬反应中也具有重要作用，陈祥荣等人研究表明，通过抑制p38MAPK通路能够减弱自噬反应，具有保护脑内神经的作用［16］。刘瑶等研究表明，抑制p38MAPK通路能够调控脑缺血后海马神经元自噬，进而发挥神经保护功能［17］。脑外伤会导致脑内神经递质谷氨酸大量释放，研究表明，高浓度的谷氨酸会产生神经毒性，甚至导致神经细胞死亡［18］，而GLT-1能够将谷氨酸转运进细胞内，谷氨酸在细胞内转变成谷氨酰胺，因此，上调表达GLT-1能够减轻脑外伤后的神经元自噬和神经损伤［19］。本研究表明，葛根素能够下调p-p38MAPK表达，同时能够上调GLT-1表达，且随着Pue剂量的增加，p-p38MAPK的表达水平显著下降、GLT-1的表达水平显著提高，且呈剂量依赖性。结果提示，葛根素能够下调p-p38MAPK表达、上调GLT-1表达，进而起到神经保护的作用。

综上所述，葛根素对TBI大鼠神经具有保护作用，这一作用可能通过抑制p38MAPK通路活性和上调GLT-1的表达水平来实现的，为脑外伤靶向药物的开发和治疗供一定的理论基础。

［1］李跃池，王苏弘，屈洪涛.创伤性颅TBI注意障碍的神经影像电生理研究进展［J］.临床神经外科杂志，2016，13（2）：155-157.

［2］张小年，赵春禹，崔利华，等.TBI的并发症和继发障碍的康复治疗［J］.中国康复理论与实践，2008，14（7）：648-651.

［3］骆良钦，陈祥荣，李亚松，等.JNK信号通路在大鼠创伤性脑损伤后炎症反应中的作用［J］.中华神经医学杂志，2014，13（12）：1233-1238.

［4］徐兆景.Pue药理作用机制探讨及临床应用［J］.中国现代药物应用，2016，10（8）：256-257.

［5］李国亮，邸方，杨亚东.Pue对大鼠颅脑损伤的保护作用［J］.中国临床神经外科杂志，2016，31（8）：479-482.

［6］Florian B，Vintilescu R，Balseanu AT，et al.Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia［J］.Neuroscience Letters，2008， 438（2）：180-185.

［7］吴敏玲，卢虹，李译蓉，等.脑电图辅助下中西医结合治疗轻型颅 TBI的疗效观察［J］.现代诊断与治疗，2016，27（13）：2399-2400.

［8］汪春，郭知学，李鸥，等.中药早期介入对脑外伤偏瘫患者运动功能的影响［J］.中国康复理论与实践，2011，17（7）：123-125.

［9］李逊．TBI后综合征的辨证治疗探讨［J］.陕西中医，2009，30（6）：702-703．

［10］江涛，鄢泽然，疏欣扬，等.TBI后综合征的中医治疗探讨［J］.实用中医内科杂志，2012，26（6）：1-2.

［11］赵海臣，杨维明，陈萌，等.葛根素治疗脑外伤后综合征的临床疗效［J］.世界临床医学，2016，10（5）：90.

［12］冯纳婷，冯雅碧.葛根素对大鼠颅脑损伤后ICAM-1和NF-κB 表达的影响［J］.实用医药杂志，2014，31（4）：327-329.

［13］刘继新，依斯哈尔·巴拉提，王志丹，等.Apelin-13对兔脑外伤模型中自噬相关蛋白表达中的影响及其机制［J］.中华实验外科杂志，2016，33（2）：400-403.

［14］林超.NLRP3介导的神经炎症反应在颅脑创伤中的作用及机制研究［D］.南京：南京医科大学，2017.

［15］徐小涵.红景天苷、葛根素对高糖培养SD大鼠海马神经元凋亡的影响及其机制研究［D］.北京：北京协和医学院，2014.

［16］陈祥荣，汤志辉，李亚松，等.自噬反应对大鼠创伤性颅脑损伤后神经功能的影响及机制研究［J］.中华神经医学杂志，2016，15（12）：1200-1205.

［17］刘瑶，赵雅宁，李建民，等.P38MAPK通路对脑缺血后处理大鼠海马自噬的影响［J］.西安交通大学学报：医学版，2017，38（4）：522-528.

［18］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats ［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［19］Persson M，Rönnbäck L.Microglial self-defence mediated through GLT-1 and glutathione ［J］.Amino Acids，2012，42（1）：207-219.