复方溃结康灌肠液对葡聚糖硫酸钠诱导溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜的保护作用*

毛堂友 陈 晨 史 瑞 谢添弘 郭 一 石 磊刘佳丽 谭 祥 丁庞华 姜 慧 李军祥

（北京中医药大学东方医院，北京 100078）

溃疡性结肠炎（UC）是炎症性肠病的主要表现形式之一，是一种结肠和直肠的非特异性炎症性疾病［1-2］，目前其病因及发病机制均尚不清楚，也尚无确切有效的治疗方法，极大地影响了患者的身心健康。本课题组在前期临床观察中发现［3］，复方溃结康灌肠液对UC的治疗具有较好的临床效果，但其作用机制不明。因此，本研究利用葡聚糖硫酸钠（DSS）制备UC大鼠模型，探讨复方溃结康灌肠液对UC大鼠结肠黏膜的保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只健康SD雄性SPF级大鼠，体质量（200±20）g。购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2011-0004。常规饲养于中国中医科学院中药研究所SPF级动物房，12 h光照/黑夜循环，温度20～24℃，湿度50%～60%，自由饮食饮水饲养。

1.2 试剂与仪器 复方溃结康灌肠液组成：苦参15 g，青黛5 g，地榆炭 30 g，五倍子10 g。剂型为配方颗粒，由北京中医药大学东方医院配方颗粒药房统一购自于北京康仁堂药业有限公司。美沙拉嗪灌肠液（mesalazine，商品名为莎尔福）购自德国Losan Pharma GmbH 公司。 DSS （MW36-50KDa；MP Bio-medical，Burlingame，CA，USA），便潜血试纸（珠海贝索生物技术有限公司）；UCT型超薄切片机（德国莱卡公司），全自动多功能酶标仪（MULTISKAN MK3，美国）。

1.3 造模与分组 本课题组的动物模型建立方法参考文献［4］，继续采用自由饮用4.5%DSS溶液制备UC大鼠模型，将60只大鼠适应性饲养1周后，以4.5%DSS（MW 36000-50000，MP Biomedical）溶液自由饮水7 d，普通饲料喂养，昼/夜12/12 h交替，温度25℃，湿度60%。同时运用随机数字表法将大鼠随机均等分为正常组、模型组、中药低剂量组（787.5 mg/kg）、中药中剂量组（1575 mg/kg）、中药高剂量组（3150 mg/kg）、美沙拉嗪组（5 mL/kg）。造模的同时各组均以相应药物灌肠治疗7 d。

1.4 实验方法 将大鼠称重后，按照0.3 mL/100 g体质量以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠翻身反射消失为麻醉成功。将麻醉成功后的大鼠仰卧位固定于鼠板上，用直径为2 mm橡胶软管涂抹液体石蜡油润滑后由大鼠肛门缓慢轻插入直肠约8 cm。一次性缓慢推注事先备好的溶液1 mL/200 g体质量，5 min之内完成，尽量减少液体流出量，灌肠成功后保持大鼠仰卧位臀部向上15 min。正常组和模型组均给10 mL/kg鼠体质量的0.9%氯化钠注射液，一次性缓慢推注事先配好的灌肠方1 mL/200 g体质量，5 min之内完成，尽量减少液体流出量。正常组和模型组均灌入等量的0.9%氯化钠注射液，正常组灌入等量去离子水，美沙拉嗪组灌入等量的美沙拉嗪灌肠液，中药高、中、低剂量组灌入相应等量的复方溃结康灌肠液。灌肠成功后保持大鼠仰卧位臀部向上15 min，自然苏醒后放回笼中，常规饲养。各组均灌肠给药，每日1次，连用7 d。每日称取大鼠体质量，检测便潜血，确保造模7 d中大鼠均维持便血状态，造模结束后查看大鼠结肠病理，结肠黏膜病变不超过黏膜下层，炎症细胞侵润明显，使得模型维持在炎症阶段，避免异型增生的干预。各组大鼠末次给药后，禁食不禁水，24 h后取材，分离远端结肠10 cm，-80℃冻存备用。

1.5 标本采集与检测 1）疾病活动指数评价。见表1。每日称取大鼠体质量，观察大便性状，并用便潜血试剂盒检测便潜血，以评估疾病活动指数（DAI）［5］。 计算公式：DAI＝（体质量下降指数+大便性状+大便潜血）/3。DAI评估由非课题组成员完成。2）结肠组织病理学评分。见表2。石蜡切片常规HE染色后光学显微镜下观察评分。结肠组织病理学评分（HS）评分标准［6］如下，包括炎细胞浸润程度、溃疡、病变层次。组织病理学评分均由非课题组成员在病理老师指导下完成。3）结肠组织MPO活性检测。取肛门以上结肠1 cm冰0.9%氯化钠注射液洗净，匀浆、离心后取上清，应用化学比色法来检测 MPO 的活性［7］。

表1 疾病活动指数的评分标准

表2 结肠组织病理学的评分标准

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示。符合正态分布且方差齐进行单因素方差分析（One-way ANOVA），不符合正态分布或方差不齐进行非参数检验，均为组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 复方溃结康灌肠液对DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠DAI指数的影响 见表3。本次实验过程中，共有6只大鼠死亡，其中正常组2只，低剂量组1只，高剂量组3只。造模后第2日，模型组大鼠及出现便潜血阳性，毛色、体质量计活动度无明显变化。随着DSS饮用量的增加，大鼠便血情况加重，开始出现肉眼血便，而毛色逐渐失去光泽，活动性变差，反应较为迟缓、懒动。至第7日DAI到最大。中药各剂量组大鼠毛色、活动度及反应情况肉眼观与模型组并无明显差异，便血情况好转；与正常组比较，模型组DAI明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，中药各剂量组及美沙拉嗪组较明显的下降（P＜0.01）。

表3 复方溃结康灌肠液对DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠DAI指数的影响（±s）

表3 复方溃结康灌肠液对DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠DAI指数的影响（±s）

与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。 下同。

组 别 n正常组 8模型组 10中药低剂量组 9 DAI指数0.08375±0.2369 3.035±0.4842△△1.999±0.6227△△中药中剂量组 10 2.066±0.6625△△中药高剂量组 7 1.430±0.6596△△美沙拉嗪组 10 2.034±0.3978△△

2.2 复方溃结康灌肠液对DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠病理的影响 见图1，表4。模型组结肠黏膜充血、水肿，大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主；杯状细胞明显减少，黏膜连续性被破坏，可见深至黏膜下层的溃疡，病变集中在黏膜层级黏膜下层。各治疗组充血、水肿减轻，炎细胞浸润减轻。与正常组比较，模型组结肠组织病理学评分显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，中药各剂量组及美沙拉嗪组结肠组织病理学评分均显著降低（P＜0.01）。

图1 复方溃结康灌肠液治疗DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠结肠病理图（HE染色，100倍）

表4 复方溃结康灌肠液对DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠病理评分的影响（分，±s）

表4 复方溃结康灌肠液对DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠病理评分的影响（分，±s）

与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。 下同。

组 别 n正常组 8模型组 10中药低剂量组 9病理评分1.985±0.2962 8.130±0.6784**4.637±0.5977△△中药中剂量组 10 3.876±0.3442△△中药高剂量组 7 4.105±0.1185△△美沙拉嗪组 10 4.137±0.1867△△

2.3 复方溃结康灌肠液对DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠MPO的影响 见表5。与正常组比较，模型组结肠MPO活性显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，中药各剂量组及美沙拉嗪组结肠组织MPO活性均显著降低（P＜0.01）。

表5 复方溃结康灌肠液对DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠MPO 的影响（±s）

表5 复方溃结康灌肠液对DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠MPO 的影响（±s）

组 别 n正常组 8模型组 10中药低剂量组 9 MPO 28.84±6.971 56.38±5.954**42.77±7.029△△中药中剂量组 10 36.38±11.70△△中药高剂量组 7 38.54±9.565△△美沙拉嗪组 10 34.09±6.301△△

3 讨 论

目前为止，西医尚无治疗UC的特效药物，诱导缓解、维持缓解、防治UC相关的并发症，成为目前UC治疗的三大目标［8-9］。目前常用的治疗药物包括水杨酸类、类固醇激素、免疫抑制剂、生物制剂等［10-11］，不仅疗效不突出，还存在各种各样的问题，例如临床使用水杨酸类和类固醇激素类药物存在药物不耐受，副作用明显，疗程长，复发率高的问题，免疫抑制剂和生物制剂的使用处在研究及临床试验阶段，其疗效及安全性评价仍需要进一步研究［12］。因此，急需寻找新的治疗方法。中药保留灌肠治疗UC疗效显著，使高浓度药物直达患处，提高肠内局部血药浓度，药物的有效成分与肠道病变黏膜接触后即可发挥作用，再经过肝肠循环，最后通过血液循环输送到全身，大大降低了肝肠循环、首过效应消除对药物有效成分的影响，并且具有副作用小、费用低、复发率低的优势，成为最近治疗溃疡性结肠炎的研究热点［13-14］。

复方溃结康灌肠液是北京中医药大学东方医院消化内科李军祥教授经过多年临床总结的临床经验方，主要针对本病的湿热内蕴，夹有瘀血的标实进行治疗，清肠利湿、化瘀止血，在临床上对溃疡性结肠炎（直肠和乙状结肠型）进行局部灌肠治疗，取得了很好的疗效。 本方由苦参15 g，青黛5 g，地榆炭30 g，五倍子10 g组成，其中苦参苦、寒，功效清热燥湿，青黛咸、寒，功效清热凉血解毒，两药合用具有清热利湿解毒的作用；重用地榆炭苦、酸、凉，功效凉血止血、解毒敛疮，五倍子酸、涩、寒，收敛止血，《本草拾遗》记载，五倍子能够治肠虚泄痢；诸药合用，共奏清肠利湿、化瘀止血之效。我们在前期临床研究中已经观察到复方溃结康灌肠液能改善UC患者腹痛腹泻、黏液脓血便和里急后重的症状，但是作用机制不明确，因此本研究采用4.5%DSS溶液自由饮用以制备UC大鼠模型，意在探讨本方对UC大鼠结肠黏膜的保护作用。

本实验发现，经DSS诱导的UC大鼠第2日即开始出现便潜血阳性、大便稀溏、体质量下降、毛色光泽变差、活动性差、反应迟缓等表现；随着时间的延长，DAI指数不断升高，至第7日达到最大；结肠病理光镜下可见结肠黏膜充血、水肿，大量炎性细胞浸润（以中性粒细胞为主）；黏膜连续性被破坏，可见深至黏膜下层的小溃疡，HS评分较正常组明显升高，特点与人类UC比较吻合。另外，我们也对结肠组织进行了MPO检测，MPO主要存在于炎症细胞，尤其是中性粒细胞的细胞质中，其活性反映了组织中炎症细胞的浸润程度，因此，MPO可作为UC急性期疾病活动严重程度的检测指标，是UC病情活动的标志物［15］。研究发现，DSS诱导的结肠炎大鼠MPO值较正常组明显升高，说明结肠组织的炎症细胞浸润明显增加。经过复方溃结康灌肠液治疗后，大鼠的DAI指数、HS评分以及MPO活性都较模型组有明显的降低，由此表明，复方溃结康灌肠液对DSS诱导溃疡性结肠炎大鼠有较好的治疗作用，能够明显改善腹痛腹泻、脓血等临床症状，还能降低结肠炎症细胞的浸润，保护结肠黏膜免受损伤。

本次研究通过动物实验初步探讨了复方溃结康灌肠液对DSS诱导UC大鼠结肠黏膜的保护作用及其机制，但进一步的作用机理仍不清楚，还需要我们后续进一步的研究。

［1］Moon W.Golimumab therapy in ulcerative colitis［J］.Korean J Gastroenterol，2016，67（2）：64-73.

［2］Hao Y，Nagase K，Hori K，et al.Xilei San ameliorates experimental colitis in rats by selectively degrading pro-inflammatory mediators and promoting mucosal repair［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014：569587.

［3］李宁飞.清肠温中方口服和灌肠方联合西药治疗重度活动期溃疡性结肠炎的临床研究［D］.北京中医药大学，2016.

［4］Tangyou Mao，Rui Shi，Weihan Zhao，et al.Qingchang wenzhong decoction ameliorates dextran sulphate sodium-induced ulcerative colitis in rats by downregulating the IP10/CXCR3 axis-mediated inflammatory response［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2016，2016（4312538）.

［5］Sasaki S，Hirata I，Maemura K，et al.Prostaglandin E2 inhibits lesion formation in dextran sodium sulphate-induced colitis in rats and reduces the levels of mucosal inflammatory cytokines［J］.Scand J Immunol，2000，51：23-28.

［6］Dieleman LA，Palmen MJ，Akol H，et al.Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium （DSS）is characterized by Th1 and Th2 cytokines［J］.Clin Exp Immunol，1998，114：385-391.

［7］Mallakin A，Kutcher LW，McDowell SA，et al.Gene expression profiles of Mst1r-deficient mice during nickel-induced acute lung injury［J］.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology，2006，34（1）：15-27.

［8］Kornbluth A，Sachar DB.Practice parameters committee of the American College of Gastroenterology.Ulcerative colitis practice guidelines in adults：American College of Gastroenterology， Practice Parameters Committee ［J］.Am J Gastroenterol，2010，105：501-523.

［9］Blonski W，Buchner AM，Lichtenstein GR.Treatment of ulcerative colitis［J］.Curr Opin Gastroenterol，2014，30：84-96.

［12］Torres J，Boyapati RK，Kennedy N，et al.Systematic review of effects of withdrawal of immunomodulators or biologic agents from patients with inflammatory bowel disease［J］.Gastroenterology，2015，149（7）：1716-1730.

［15］Hansberry DR，Shah K，Agarwal P3，et al.Fecal Myeloperoxidase as a biomarker for inflammatory bowel disease ［J］.Cureus，2017，9（1）：e1004.