牦牛Cyclin D1基因的克隆及IGF-I对其在睾丸支持细胞表达的影响

王亚营，潘阳阳，叶小琳，李谷月，何翃闳，王 萌，樊江峰，崔 燕，余四九

(甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070)

牦牛是能够适应高寒低氧环境的珍稀物种，主要分布在我国青藏高原海拔3 000 m以上的地区，具有重要的经济价值，但其自然繁殖率低，限制了牧区的发展。在牦牛上应用辅助生殖技术(Assisted reproductive technology，ART)是提高其繁殖率的重要手段，而雄性牦牛提供高质量的精子是体外繁殖成功的前提。睾丸支持细胞(Sertoli cell，SC)是唯一与生精细胞(Germ cell，GC)直接接触的体细胞，其共同构成睾丸曲细精管。睾丸支持细胞结构上紧密相连构成了血-睾屏障(Blood-testis barrier，BTB)，为生殖细胞的发育提供独特的微环境[1]。睾丸支持细胞产生一系列蛋白质来调控垂体激素的释放，从而影响生殖细胞减数分裂的活性并促进精子的释放[2]，对生精过程起到至关重要的调控作用。成年雄性动物睾丸的大小、生殖细胞的数量以及精子质量与SC的数量直接相关[3]。

细胞周期蛋白(Cyclins)是调控细胞周期进程的一系列蛋白质。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)高表达于细胞G1期，与细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(Cyclin-dependent kinase4/6，CDK4/6)结合，形成Cyclin D1-CDK4/CDK6复合物，之后与磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白(Phosphorylation retinoblastoma protein，pRb)结合，使细胞由G1期进入S期，促进细胞周期进程。G1/S是细胞周期中重要的时间点，其决定细胞是否进行分裂增殖[4-5]。研究表明，Cyclin D1促进睾丸间质细胞的增殖并抑制其凋亡[6]。将小鼠胚胎干细胞中CyclinD1基因的部分外显子用非编码序列替换，得到缺乏Cyclin D1蛋白的突变鼠，其在发育过程中表现出生殖障碍等多种症状[7]。胰岛素样生长因子-I(Insulin-like growth factor-I，IGF-I)是一种促生长因子，对生殖器官的功能起到重要的调控作用。IGF-I通过调控Bax和Bcl-2等凋亡相关基因，降低了卵丘细胞[8]、卵母细胞[9]和睾丸间质细胞[10]等的凋亡率，同时还提高精子在低温环境中的运动能力及冷冻复苏的活性[9,11]。IGF-I显著提高牦牛冻精活性和体外授精胚胎的囊胚产量，并且降低了囊胚中细胞凋亡比率[12-13]。缺乏胰岛素受体(Insulin Receptor，InsR)和胰岛素样生长因子受体(Insulin-like growth factor Receptor，IGFR)的小鼠，睾丸支持细胞增殖率降低，从而导致精子产量降低，成年后睾丸的尺寸比正常鼠小75%[14]。IGF-I在维持与生殖相关细胞的正常生理功能方面发挥着重要作用，然而IGF-I是否调控睾丸支持细胞中周期相关蛋白的表达尚不清楚，牦牛CyclinD1基因的克隆及生物信息学分析在国内外也尚未见报道。

本研究以牦牛睾丸支持细胞为研究对象，克隆牦牛CyclinD1基因的CDS序列，并对其进行生物信息学分析；同时研究IGF-I对Cyclin D1在睾丸支持细胞中表达的影响。研究结果将为调控睾丸支持细胞的发育提供试验依据，为探索精子发生机制和提高精子质量奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

细胞培养箱(Thermo，美国)、PCR 仪(Rio-Rad，美国)、荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)、倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；DMEM/F-12、胎牛血清(Fetal Bovine serum，FBS)(Gibco)；胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、IGF-I(Sigma)；总RNA提取试剂盒(Omega)；反转录试剂盒、GoTaq Green Master Mix(Promega)；胶回收试剂盒(GenStar)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、pMD 18-T Vector(TaKaRa)；Fasl多克隆兔抗、CyclinD1多克隆兔抗以及羊抗兔多克隆抗体(博奥森)。

1.2 样品采集及细胞培养与鉴定

2016年10月在青海省西宁市乐家湾屠宰场，采取健康5～8月龄(此阶段为牛睾丸支持细胞的增殖分化期)牦牛的睾丸样品。获得样品后，将其放入生理盐水(含双抗)中，再置于冰盒密封，4 h内送到实验室，并对其进行处理。牦牛睾丸支持细胞的体外分离培养与鉴定参考M.D.Anway等[15]和H.Zhang等[16]的操作方法，采用两次酶消化法获得睾丸支持细胞，20 mmol·L-1Tris-Hcl低渗处理和饥饿培养以纯化细胞，再用含10% FBS的培养液培养细胞，细胞生长至80%以上融合时，用0.25%的胰酶消化细胞，调整细胞密度为5×104·mL-1，爬片培养48 h，采用Fasl免疫细胞化学方法鉴定细胞。

1.3 引物设计

根据GenBank中牛(Bostaurus)的CyclinD1和β-actin序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计牦牛的CDS序列扩增引物Cyclin D1-C、荧光定量检测引物Cyclin D1-Y和β-actin内参引物。引物序列送上海华大基因科技公司合成。引物序列详见表1。

表1 目的基因和内参基因引物序列

Table 1 Primer sequences of target and reference genes

引物Primer引物序列(5'-3')Primersequence产物大小/bpProductsize退火温度/℃TmCyclinD1-CF:CCCAACCATGGCACACCR:CCCAACCATGGCACACC100960CyclinD1-YF:CGGTGTCCTACTTCAAGTGTGTGR:GACAGGAAGCGGTCCAGGTA14860β-actinF:AGGCTGTGCTGTCCCTGTATGR:GCTCGGCTGTGGTGGTAAA20058

1.4 牦牛CyclinD1基因的克隆及生物信息学分析

当原代SC生长至80%以上融合时，提取细胞总的RNA，再反转录成cDNA，置于冰箱-20 ℃，保存备用。以cDNA为模板， Cyclin D1-C为引物进行PCR扩增。反应体系：cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，GoTaq Green Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃ 5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，对目的条带进行胶回收，将纯化后的DNA与pMD 18-T Vector 载体连接，转染到JM109感受态细胞，培养获得的菌液，送至上海生工生物工程公司进行测序。测序完成之后，将结果进行拼接，并对其进行生物信息学分析。利用NCBI在线软件Open reading frame finder(ORF Finder)对基因进行开放阅读框(Open reading frame，ORF)分析；利用MEGA7.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joining)绘制系统进化树；利用 DNAMAN对核苷酸和氨基酸的同源性进行分析。

1.5 细胞免疫荧光法对蛋白质表达进行定位

选取纯化后的牦牛SC，将细胞密度调整为5×104·mL-1进行细胞爬片。培养48 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，置于冰箱，4 ℃过夜；0.5%Tritonx-100透化1 h；1%BSA溶液室温封闭2 h；CyclinD1抗体稀释液(1∶100)孵育细胞，冰箱4 ℃过夜；二抗稀释液(1∶100)孵育细胞，室温2 h；5 ng·mL-1的DAPI染细胞核3 min；置于倒置荧光显微镜下拍照。每个步骤之间用PBS将玻片洗净，且二抗孵育后应避光操作。

1.6 qRT-PCR检测CyclinD1基因表达

选取纯化后的牦牛SC，以1×105·mL-1的细胞密度接种于6孔板中，每孔接种2 mL细胞悬液，培养24 h(使细胞全部处于静止期)后，加入IGF-I，使其终浓度分别为0、25、50、100、150 ng·mL-1，每个浓度3个重复，24 h后提取细胞总RNA。IGF-I作用时间根据牦牛睾丸支持细胞分裂周期选取[16]。反转录后，将cDNA浓度调至200 ng·μL-1，通过qRT-PCR检测CyclinD1 mRNA的表达。反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，Rox Reference DyeⅡ 0.4 μL，ddH2O 7.6 μL，共20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s,60 ℃退火34 s，共40个循环。

1.7 Western blotting检测CyclinD1蛋白表达

细胞培养及因子作用等与1.6中相同，提取细胞总蛋白。获得的蛋白质样品与蛋白上样缓冲液(4×)按3∶1混合，置于100 ℃温箱中，煮10 min，使蛋白质充分变性；变性后的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离；在300 mA恒定电流条件下，将凝胶上的目的蛋白转到PVDF膜上；用5%脱脂奶粉溶液，将膜封闭2 h；Cyclin D1抗体4 ℃孵育过夜；二抗常温孵育2 h；加电化学发光显色液(Electrochemi- luminescence, ECL)避光显色，X光片曝光，扫描蛋白条带。

1.8 数据分析

2 结 果

2.1 牦牛睾丸支持细胞培养与鉴定

纯化培养获得原代牦牛SC(图1 A)和三代SC(图1 B)，均生长良好。Fasl免疫细胞化学法显示，Fasl蛋白在该细胞表达呈阳性(图1 C)，阴性对照不表达(图1 D)，由此可确定试验所用为纯度较高的牦牛睾丸支持细胞。

A. 原代SC； B. 三代SC；C. Fasl阳性表达；D.阴性对照A. The first generation of SC；B. The third generation of SC；C. Positive staining for Fasl；D. Negative control图1 牦牛睾丸支持细胞的培养和鉴定(标尺：100 μm)Fig.1 The cultivation and identification of the yak Sertoli cells (Scale bar: 100 μm)

2.2 CyclinD1基因的克隆及生物信息学分析

Cyclin D1-C进行RT-PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳显示，预期位置有明显荧光条带(图 2)。利用NCBI在线软件BLAST对拼接后的序列进行比对，Cyclin D1-C扩增产物序列与牛的CyclinD1(NM_001046273.2)序列为99%相似。将牦牛CyclinD1序列提交至GenBank，登录号为KY 420723。

ORF分析表明，该基因编码区长888 bp，起始密码子在8 bp处，终止密码子在895 bp处，编码295个氨基酸。系统进化树结果显示(图3)，牦牛CyclinD1基因与瘤牛、黄牛和水牛的亲缘关系最近，与山羊和绵羊次之，与人和猫的亲缘关系最远。同源性分析结果表明(表2)：牦牛Cyclin D1核苷酸序列同源性与黄牛和瘤牛的最高，为99.9%；与人的最低，为92.2%。牦牛Cyclin D1氨基酸序列同源性与黄牛、瘤牛和水牛的同源性均为100%，与人的同源性为93.5%。

M. DL2000 DNA分子质量标准；1～2. Cyclin D1 基因扩增产物M. DL2000 DNA marker; 1-2. Cyclin D1 RT-PCR products图2 牦牛Cyclin D1基因的RT-PCR产物电泳结果Fig.2 Agarose gels electrophoresis results of Cyclin D1 RT-PCR products

图3 Cyclin D1 基因系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Cyclin D1

2.3 Cyclin D1蛋白在SC中的分布与定位

细胞免疫荧光显示(图4)，Cyclin D1蛋白在SC胞核上高表达，部分细胞核中呈强表达，在SC胞质上呈极微弱表达。

表2 牦牛和不同物种间CyclinD1基因序列和氨基酸序列同源性比较

Table 2 Homologous comparisons of nucleotide and amino acids sequences of yakCyclinD1 gene with that of other species %

A. Cyclin D1；B. DAPI；C.合成A. Cyclin D1；B. DAPI；C. Merge图4 牦牛SC Cyclin D1蛋白表达免疫荧光技术检测(标尺：100 μm)Fig.4 The detection of Cyclin D1 protein on yak SC by immunofluorescence method (Scale bar: 100 μm)

2.4 IGF-I对牦牛SC 中Cyclin D1 mRNA的调节

IGF-I作用于体外培养的SC，对获得的样品进行qRT-PCR分析，结果显示(图5)：IGF-I浓度为25和150 ng·mL-1时，CyclinD1 mRNA表达量与对照组差异不显著(P>0.05)，前者表现促进，后者表现抑制；IGF-I浓度为50和100 ng·mL-1时，CyclinD1 mRNA表达量显著高于其他各组(P<0.05)，其中50 ng·mL-1组的表达量最高，为对照组的1.65倍。

不同字母表示差异显著(P<0.05)；相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同Different letters mean significant difference (P<0.05); same letter means no significant difference (P>0.05). The same as below图5 不同浓度IGF-I对Cyclin D1 mRNA表达的影响Fig.5 Effect of different concentration of IGF-I on Cyclin D1 mRNA expression

2.5 IGF-I对牦牛SC 中Cyclin D1 蛋白的调节

不同浓度IGF-I加入体外培养的SC，作用24 h，对获得的蛋白样品进行Western blotting，结果显示(图6和7)：与对照组相比， IGF-I作用组的Cyclin D1蛋白的表达量均有提高，IGF-I浓度为100 ng·mL-1组蛋白表达量与对照组差异不显著(P>0.05)，IGF-I浓度为25、50和150 ng·mL-1组蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)，其中，50 ng·mL-1组的蛋白表达量最高，为对照组的1.20倍。

1～5. 0、25、50、100、150 ng·mL-1 IGF-I1-5.0, 25, 50, 100, 150 ng·mL-1 IGF-I图6 Cyclin D1和β-actin蛋白检测Fig.6 The detection of Cyclin D1 and β-actin protein

图7 不同浓度IGF-I对Cyclin D1蛋白表达的影响Fig.7 Effect of different concentration of IGF-I on Cyclin D1 protein expression

3 讨 论

本研究成功克隆出牦牛CyclinD1基因的CDS序列(GenBank登录号：KY 420723)。生物信息学分析显示，牛属动物CyclinD1核酸序列同源性达到99%以上，氨基酸序列完全一致，与其他物种相比均有较高同源性，表明CyclinD1基因在进化过程中具有保守性。 Cyclin D1蛋白在细胞中呈周期性表达，于G1期表达量最高。异步生长的人成纤维细胞免疫荧光结果显示， Cyclin D1蛋白在绝大多数细胞中呈阳性表达，且定位于细胞核[17]。本研究中，用于免疫荧光检测的SC未做同步生长处理，其结果显示，绝大多数细胞核中高表达Cyclin D1蛋白，这与前人的研究结果一致，但胞核中Cyclin D1的荧光强度并不同，可能由于细胞处于周期进程中的不同阶段。

A. Dance等[18]通过细胞计数证明，IGF-I促进体外培养的牛SC数目增殖。本研究则从分子水平进行探究，分析不同浓度的IGF-I对牦牛睾丸支持细胞中Cyclin D1基因和蛋白表达的影响，结果显示：添加IGF-I后，Cyclin D1基因和蛋白的表达量总体上升，且具有剂量依赖性，表明IGF-I可以通过调控Cyclin D1的表达，促进SC周期进程，引起细胞增殖；但高浓度的IGF-I可能激活了抑制Cyclin D1表达的途径，在本研究中，IGF-I 为150 ng·mL-1时，试验组CyclinD1 mRNA表达量低于对照组(P>0.05)，可能与PI3K介导的胰岛素家族的负调控机制有关[19]。P.Ye等[20]研究发现，100 ng·mL-1的IGF-I作用于大鼠少突胶质细胞24 h，CyclinD1 mRNA表达量为对照组的7倍；Y. Jiang等[21]发现，100 ng·mL-1的IGF-I作用于鼠系膜细胞，Cyclin D1蛋白表达量为对照组的1.6倍。在本研究中，IGF-I 为100 ng·mL-1时，Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达量分别为对照组的1.21和1.05倍。IGF-I作用于细胞时，首先与细胞表面的受体相结合，激活下游分子。研究显示，不同组织器官中IGF-I及其受体的含量[22-23]与活性[24]均不同。因此，以上差异可能与试验对象在机体内的位置及功能有关，提示生长因子对生殖器官的调控可能存在特异性。本研究中Cyclin D1基因和蛋白表达呈现一定差异性，可能是由于Cyclin D1蛋白表达过程受到多条信号通路的调控。目前研究表明，Cyclin D1至少存在两条转录后调控通路，即mTOR和/或PI3-p70S6通路和PI3 -eIF4E通路，它们可与Ras偶联，对Cyclin D1进行蛋白翻译水平的调控[25]。Ras是生长因子作用靶标，将刺激细胞生长的信号传递给下游分子，促进细胞周期进展[26]。同时，IGF-I还可以激活PI3K/Akt和MEK/ERK激酶途径，调控Cyclin D1的表达[27]。因此，Cyclin D1在SC上的表达可能受到多方面的调控。

雄性动物成年后， SC在体内不再进行增殖分化，雄性动物的生精质量在其成年之前就已决定[3]。SC的成熟障碍是多数雄性生殖障碍的根本原因，且SC的成熟障碍可能在出生之前就已经存在[28-29]。总结本研究及前人成果发现，IGF-I上调牦牛SC中Cyclin D1蛋白的表达，同时还可抑制多种生殖相关细胞的凋亡。因此，IGF-I可能通过促进牦牛SC周期进程，抑制其凋亡，从而促进SC的增殖和成熟，使其数量和质量维持正常。这对提高牦牛的生精能力及精子质量具有重要意义。

4 结 论

本研究成功克隆牦牛CyclinD1基因(GenBank登录号：KY 420723)，生物信息学分析显示，其在进化过程中高度保守，Cyclin D1蛋白主要在SC胞核表达。IGF-I上调SC中Cyclin D1基因和蛋白的表达，具有剂量依赖性，最佳作用浓度为50 ng·mL-1。IGF-I可以通过影响SC中Cyclin D1的表达调控睾丸发育，从而影响雄性胚胎的生殖发育和成年动物的精子质量。

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