UDCA联合维生素D治疗原发性胆汁性肝硬化患者外周血T细胞亚群变化及其对疗效的影响

陈小君，宋洋

受对疾病的认识及抗线粒体抗体（anti-mitochondrial antibody，AMA）检测普及的影响，原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）在我国的检出率逐渐增加[1，2]，该病属于自身免疫性疾病，

主要表现为慢性进展性肝内中小胆管非化脓性炎症，持续发展可演变为肝硬化或肝衰竭[3]。目前，临床主要应用熊去氧胆酸（UDCA）治疗。临床研究显示该药能够有效改善患者临床症状及肝功能，进而延缓疾病进展，改善预后[4，5]。但报道亦指出，约40%患者对该药治疗不应答[6]。近年，有报道显示维生素D对部分自身免疫性疾病治疗有效，且发现其有抑制肝纤维化发生发展的作用[7]。本研究尝试应用UDCA和维生素D治疗PBC患者，以观察治疗应答情况，并观察了外周血T细胞亚群的变化，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例来源 2014年1月～2015年12月我院收治的PBC患者92例，男28例，女64例；年龄44～65岁，平均年龄（52.7±12.1）岁。诊断参考2009年美国肝病学会（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）制定的标准诊断，符合反映慢性胆汁淤积的血生化指标改变，主要是外周血碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）升高，AMA阳性。肝功能Child-Pugh A级72例，B级20例；Ludwig组织学分级Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期38例。排除合并自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎及其它急慢性肝脏疾病患者，排除合并严重的心肺疾病、妊娠及哺乳期妇女。采用随机数字表法将患者分为两组，两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。所有患者均对本研究知情且签署同意书，本研究获得我院医学伦理委员会批准。

1.2 治疗方法 对照组应用UDCA胶囊（四川科瑞德制药有限公司，国药准字H20123205）13～15 mg.kg-1·d-1或250 mg口服，3次/d；观察组在此基础上给予维生素D2软胶囊（大连水产药业有限公司，国药准字H20073445）1200 IU口服，1次/d。所有患者在接受治疗后的第4 w、12 w、24 w来院复查，明确无明显不良反应后，长期维持治疗。

1.3 检测 使用美国Roche E-602全自动免疫分析仪及其配套试剂检测外周血25-羟基维生素D[25-hydroxy vitamin D，25（OH）D]；常规检测血生化指标；使用流式细胞术（FACS Calibur流式细胞仪，美国BD）检测外周血CD4+Treg和Th17细胞水平。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0软件处理数据，计量资料以（±s）表示，采用配对或独立样本的t检验，计数资料采用卡方检验，采用双变量Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后外周血25（OH）D水平和外周血T细胞亚群变化的比较 治疗前两组外周血25（OH）D水平、CD4+Treg、Th17细胞计数和 T17/CD4+Treg比值差异无统计学意义（P＞0.05）；在持续治疗1年后，观察组外周血25（OH）D水平和CD4+Treg细胞计数明显高于对照组，Th17细胞计数和Th17/CD4+Treg比值明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，表1、图1）。

2.2 两组治疗前后肝功能指标变化 治疗前，两组肝功能指标差异无统计学意义（P＞0.05）；在持续治疗1年后，观察组血清ALT、AST、ALP、GGT水平均明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

2.3 血清25（OH）D与外周血Th17、CD4+Treg细胞、Th17/CD4+Treg比值相关性分析 对两组患者治疗前后各指标行Pearson相关性分析，结果显示血清25（OH）D水平与CD4+Treg细胞百分比呈明显正相关（r=0.961，P=0.000，图2），而血清 25（OH）D 水平与Th17细胞或Th17/CD4+Treg比值无明显相关性（P＞0.05）。

2.4 外周血CD4+Treg细胞与肝功能指标相关性分析 经Pearson相关性分析，结果显示外周血CD4+Treg细胞百分比与血清GGT或ALP水平呈显著正相关（r=0.822，r=0.687，P 均 =0.000）。

表1 两组血清维生素D和外周血T细胞亚群（±s）比较

表1 两组血清维生素D和外周血T细胞亚群（±s）比较

与治疗前比，①P＜0.05；与对照组比，②P＜0.05

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图1 外周血T细胞亚群变化

A：根据前向角FSC和侧向角SSC参数设置淋巴细胞为R1门；B：根据FITC参数在R1门中设置CD4+淋巴细胞为R2门；C：根据PE-IL-17荧光在R2门中设定Th17细胞；D：根据APC-CD25、PE-FoxP3在R2中设定CD4+Treg细胞，其中C、D为同一患者治疗前Th17细胞和CD4+Treg细胞检测结果

图2 血清25（OH）D水平与外周血CD4+Treg细胞相关性拟合曲线 【血清CD4+Treg=0.188×血清25（OH）D-0.178，r=0.961，P=0.000】

表2 两组肝功能指标（±s）比较

表2 两组肝功能指标（±s）比较

与治疗前比，①P＜0.05；与对照组比，②P＜0.05

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3 讨论

既往多项研究探讨了维生素D与肝纤维化、肝硬化及部分自身免疫性肝病的相关性。朱陇东等[8]综述了维生素D缺乏程度对肝纤维化和肝硬化的影响，发现其与疾病程度、肝组织学病理学损伤、并发症和预后存在密切关系。邓文升等[9]在动物实验中发现1，25（OH）2D3能明显减轻四氯化碳所致的大鼠肝组织损伤，抑制肝纤维化发展，认为其作用机制可能与抑制TGF-β1及抑制HSC激活有关。于露露等[10]报道则显示25（OH）D浓度的升高与肝硬化发病风险的下降存在线性关系。基于上述结论，部分研究[11，12]进一步指出维生素D与PBC的发生及发展有关，且建议在常规应用UDCA治疗的基础上，积极补充维生素D，但尚缺乏直接的临床验证。本研究观察组在应用联合治疗1年后，肝功能指标明显改善，且改善效果明显好于对照组，提示补充外源性维生素D能够有效改善PBC患者病情。

维生素D具有一定的免疫调节作用。李敏等[13]全面地分析了维生素D与免疫系统的关系，显示维生素D可能对单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞等免疫细胞的活性有一定的影响。李海园[14]在儿童疾病发现维生素D的重要作用。国内其他研究[15-17]也报道了类似的发现。本研究也观察到血清25（OH）D与CD4+Treg细胞水平呈直线正相关。PBC属于自身免疫性疾病，其致损伤机制与免疫系统功能紊乱有关。结合本研究发现，我们认为PBC患者存在免疫功能失衡，25（OH）D可能直接影响了CD4+Treg细胞数，加用维生素D治疗可能提高了PBC患者的免疫细胞数量。

PBC患者外周血及肝脏Treg细胞比例均降低。部分研究[15，16]认为这与患者肝功能损伤有关，即Treg细胞减少，影响免疫耐受，导致针对胆管上皮细胞线粒体内膜上自身抗原的AMA大量生成与释放，其与线粒体抗原结合后可破坏靶细胞的新陈代谢，诱导功能紊乱，最终形成组织损伤。Treg细胞比例降低还会促使胆管上皮细胞表达IL-17受体，与IL-17结合后，可促进多种炎症因子，如IL-6、IL-1β等的释放，加剧局部炎症反应。本研究观察到CD4+Treg细胞与GGT、ALP水平呈显著正相关，可能正与上述因素有关。另一方面，免疫功能紊乱引起肝内胆管炎，则会影响肝脏对胆红素和ALP等经胆道排泄，又会反馈影响维生素D的吸收，形成负性循环[17]。可见，通过补充维生素D，增加CD4+Treg细胞比率，有助于延缓PBC的进程，改善患者病情。

本研究观察到两组治疗后血清25（OH）D水平上升，提示补充外源性维生素D能够有效提升患者机体25（OH）D水平。观察组患者CD4+Treg细胞计数也明显提升，Th17细胞计数下降，则提示Treg细胞失衡能获得有效的纠正。但相关性分析仅显示25（OH）D与CD4+Treg细胞有线性相关性，则提示维生素D的作用可能仅限于对CD4+Treg细胞的激活，为后续开展更具针对性的研究有一定的指导价值。

综上所述，补充外源性维生素D能够有效改善PBC患者病情，而这种治疗作用可能与其能够有效提升CD4+Treg细胞水平有关。

[1]何丽芬，赖伊杰，赖力英，等.原发性胆汁性肝硬化的临床特点.中南大学学报（医学版），2015，40（12）:1333-1339.

[2]姚定康.原发性胆汁性肝硬化的诊断.实用肝脏病杂志，2013，16（2）:99-101.

[3]张婷，马丹旭，李晞，等.原发性胆汁性肝硬化不同分期中Th17细胞及转化生长因子-β1的水平差异.中华风湿病学杂志，2015，19（8）:507-511.

[4]郭锐，覃进.随机对照试验研究UDCA治疗原发性胆汁性肝硬化患者的疗效及安全性.实用肝脏病杂志，2017，20（1）:109-110.

[5]吴颖，姚定康，朱樑，等.UDCA联合扶正化瘀胶囊治疗原发性胆汁性肝硬化临床观察.中国中西医结合杂志，2012，32（11）:1477-1482.

[6]韩炎炎，戴晓波.云芝肝泰胶囊辅助UDCA片治疗原发性胆汁性肝硬化及对患者免疫学指标的影响.中国老年学杂志，2015，35（23）:6812-6814.

[7]苏荣，席向红，唐秀英，等.25羟维生素D在原发性胆汁性肝硬化中的诊断价值.中国免疫学杂志，2016，32（12）:1830-1832，1836.

[8]朱陇东，段钟平.维生素D与肝纤维化的关系研究.胃肠病学和肝病学杂志，2013，22（10）:951-954.

[9]邓文升，顾磊，周鸿，等.1，25（OH）2D3抑制肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1和α-SMA表达的研究.肝胆胰外科杂志，2015，27（3）:214-218.

[10]于露露，尹梁宇，陈汶，等.维生素D与肝硬化发病风险关系的前瞻性研究. 中华肝脏病杂志，2013，21（3）:202-206.

[11]钟燕明，武希润，王琦，等.原发性胆汁性肝硬化患者外周血25-羟维生素D3、Th17细胞、CD4+调节性T细胞的变化及其意义.中华肝脏病杂志，2016，24（11）:829-833.

[12]杨晓丹，李莉华，范艳玲，等.维生素D受体位点基因多态性与自身免疫性肝病易感性的关系.中国医师进修杂志，2014，37（22）:41-45.

[13]李敏，彭雁忠，熊晓佳，等.维生素D与免疫.国际免疫学杂志，2014，37（5）:403-407.

[14]李海园.维生素D的免疫调节作用与儿童疾病.临床儿科杂志，2012，30（8）:792-794.

[15]李金潺，卫丹丹，李小峰，等.维生素D在自身免疫性疾病中的作用. 中国全科医学，2015，18（18）:2184-2187.

[16]何丽杰，王静，笪宇蓉，等.维生素D对慢性乙型肝炎患者免疫功能及抗病毒疗效的影响.中国免疫学杂志，2016，32（5）:729-733.

[17]尹成敏，时庆康.早期补充维生素D对早产儿免疫球蛋白和IL-2的影响. 中国生化药物杂志，2014，34（9）:157-159.

[18]高会霞，刘玉珍，袁文芳，等.原发性胆汁性肝硬化患者调节性T细胞及相关细胞因子与肝功能损伤的相关性研究.现代中西医结合杂志，2012，21（4）:345-347.

[19]钟燕明，武希润，王琦，等.原发性胆汁性肝硬化患者外周血25-羟维生素D3、Th17细胞、CD4+调节性T细胞的变化及其意义.中华肝脏病杂志，2016，24（11）:829-833.

[20]许茵，杨小娟，蒯守刚，等.原发性胆汁性肝硬化患者外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞检测及其临床意义.中国实验诊断学，2014，18（4）:592-594.