香附多糖对牛血清白蛋白诱导的肝纤维化大鼠血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1水平的影响

尚双艳，高翔

肝纤维化是乙型肝炎等多种类型慢性肝炎发展至肝硬化的前期阶段。尽管肝硬化为不可逆性病理学改变，但肝纤维化却是一个相对可逆的病变过程，故在肝纤维化阶段进行合理有效的干预是防治肝硬化的最有效途径之一[1，2]，但如何寻找有效的抗肝纤维化的药物是亟需解决的重要问题[3]。研究表明，多种中药存在着较强的护肝活性，且有较好的开发前景[4]。香附具有理气解郁、调经止痛之功效，主要用于治疗肝郁气滞，胸、胁、脘胀等[5]。尽管临床对于香附水提物及多糖成分的研究较为广泛，但将其用于抗肝纤维化的实验却鲜有报道。我们在牛血清白蛋白（BSA）诱导的肝纤维化大鼠，观察了香附多糖的抗肝纤维化作用及其对大鼠血清基质金属蛋白酶2（MMP-2）、组织金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）和转化生长因子-β（TGF-β1）的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器、药品和试剂 60只雄性SD大鼠【陕西省疾病控制中心，SCXK（陕）2016-1122】，体质量（120±10）g，室温、55%湿度、日常光照、标准饲料、自由饮水喂养。SD-09型全自动生化分析仪（武汉迈瑞惠公司），NU-721型分光光度计（保定第三分析仪器厂），CV-8型电热恒温培养箱（北京一恒有限公司），C102型多管架全自动平衡离心机（合肥市第一仪器厂），BY-08型立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯医疗设备有限公司）。BSA及福氏不完全佐剂（美国Sigma公司，武汉源聚有限公司进口、分装，批号分别为997822和998912），秋水仙碱（昆明制药股份有限公司，批号：2016110987），香附多糖（武汉健民制药公司）。检测MMP-2、TIMP-2和TGF-β1所需试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为97112301、97110923和 97116727）。

1.2 大鼠肝纤维化模型的建立[6]将大鼠随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱组、大剂量、中剂量和小剂量香附多糖组。在造模时，取9 g/L的BSA生理盐水溶液与等量的福氏不完全佐剂混合，制备成乳悬液，取0.5 ml，皮下多点注射，第1次与第2次注射之间的时间间隔为2 w，随后每隔1 w注射1次，共5次。然后，取BSA 0.2 mg尾静脉注射，2次/w，注射3 w后，将BSA的注射剂量增至0.4 mg，2次/w，继续注射 9次，共 15次，大鼠的造模时间为35 d。在造模成功后，分别给予秋水仙碱 0.1 mg·kg-1、香附多糖 200 mg·kg-1、100 mg·kg-1和50 mg·kg-1灌胃，在正常对照组和模型组则给予等量的生理盐水灌胃，1次/d，共60 d。于末次给药1 h后，用乙醚麻醉动物，经腹主动脉取血并制备血清。取左叶肝组织，经福尔马林溶液固定，制片。

1.3 检测 使用全自动血生化分析仪检测血清生化指标；采用放射免疫分析法检测血清肝纤维化指标（武汉博士德生物科技有限公司）；采用酶联免疫分析法检测血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS 22.0软件处理数据，以（±s）表示计量资料，采用方差分析进行多组间资料的比较，采用t检验进行两组间的比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织病理学表现 在光镜下，正常对照组大鼠肝组织未见异常，肝小叶结构正常，肝细胞无变性坏死，无纤维结缔组织增生；模型组大鼠肝小叶中央静脉附近出现纤维结缔组织增生，小叶内弥漫性纤维组织增生，肝小叶中央炎性细胞浸润，肝细胞脂肪变性和灶性坏死；秋水仙碱和大剂量香附多糖处理组大鼠肝组织出现纤维化，但纤维结缔组织仅限于汇管区，炎性细胞浸润少，肝细胞未出现脂肪变性和灶性坏死；中剂量和小剂量香附多糖处理组大鼠肝组织存在纤维化，但纤维结缔组织仅限于汇管区，或存在汇管区扩大现象，肝组织存在炎性细胞浸润，但未到达肝小叶中央，肝细胞出现中等程度的脂肪变性和灶性坏死（图1）。

2.2 各组大鼠血清肝功能指标的变化 对照组和秋水仙碱、大、中、小剂量香附多糖处理组大鼠血清AST和ALT水平均显著低于模型组，而血清ALB水平则显著高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现（HE，400×）

2.2 各组大鼠血清肝纤维化指标比较 对照组和秋水仙碱、大、中、小剂量香附多糖处理组大鼠血清PC-Ⅲ胶原、Ⅳ-C胶原、LN和HA水平均显著低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05，表2）。

2.3 香附多糖对肝纤维化大鼠血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1的影响 对照组、秋水仙碱、大、中、小剂量香附多糖处理组大鼠血清MMP-2水平均显著高于模型组，而血清TIMP-2与TGF-β1水平则均显著低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05，表3）。

表1 各组大鼠肝功能指标（±s）比较

表1 各组大鼠肝功能指标（±s）比较

与模型组比，①P＜0.05；与正常组比，②P＜0.05

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表2 各组大鼠血清肝纤维化指标（ng/ml，±s）比较

表2 各组大鼠血清肝纤维化指标（ng/ml，±s）比较

与模型组比，①P＜0.05；与正常组比，②P＜0.05

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表3 各组大鼠血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1水平（±s）比较

表3 各组大鼠血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1水平（±s）比较

与模型组比，①P＜0.05；与正常组比，②P＜0.05

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3 讨论

肝纤维化是多类型慢性肝病发展至肝硬化的主要必经阶段，其临床发病率较高，若不及时有效治疗可发展至肝硬化及肝癌，严重威胁患者生命健康[7，8]。随着现代化中医药的不断发展，传统中药用于肝纤维化的治疗越发受到重视[9]。香附是一种莎草科多年生草本植物，广泛分布于中国大部分地区，具有调经止痛、疏肝解郁之功效，常用于治疗疝气疼痛、乳房胀痛、胀满疼痛、肝郁气滞、胸胁胀痛、经闭痛经、脾胃气滞、月经不调及脘腹痞闷等[10，11]。现代药学研究结果表明，香附的化学成分极为复杂，且药理作用广泛，其中多糖成分具有抗炎、抗氧化应激等活性，生物碱成分具有较好的抗抑郁活性，而总黄酮则可有效降低糖尿病患者血糖水平[12-15]。鉴于香附多糖可有效缓解机体炎症反应，改善氧化应激紊乱，而上述作用对于肝纤维化均具有重要意义，故我们用其防治肝纤维化，期望为该药的研发及防治肝纤维化提供一定的依据。

BSA所致肝纤维化大鼠是药学研究中常用的肝纤维化模型，主要是指在BSA的刺激下，肝脏星状细胞（HSC）的活化和增殖能力增强，并逐渐转变为成纤维细胞，造成肝脏细胞外基质（ECM）的合成及ECM异常沉积明显增多，最终导致肝纤维化[16]。MMP-2是一类锌钙依赖性的蛋白水解酶，可有效降解肝脏组织中ECM，尤其是在IV型胶原的降解中具有至关重要的作用[17，18]。TIMP-2则可抑制MMP-2的降解ECM作用，由于MMP-2与TIMP-2之间的平衡对于机体调节ECM的作用非常重要，而长期炎症刺激等各类型致病因素可引起HSC活化，造成MMP-2合成量降低，而TIMP1的合成量增高，导致合成的ECM降解降低，使其沉降于肝组织内，最终形成肝纤维化[19]。反之，减少机体内TIMP-2含量，增加MMP-2水平则可缓解甚至逆转肝纤维化进程。TGF-β1是机体中具有多类型生物学活性的细胞因子，其能够促进纤维基因的表达作用，同时该蛋白还可上调TIMPS的合成，抑制MMPS的活性，从而抑制ECM的降解，促进ECM的合成和沉淀，最终造成肝纤维化的形成[20]。

本研究血清学检测结果显示，大、中、小剂量香附多糖处理组大鼠血清ALT、AST、PC-Ⅲ胶原、Ⅳ-C胶原、LN、HA等水平均明显低于模型组，且MMP-2含量均明显高于模型组，而TIMP-2和TGF-β1水平明显低于模型组，提示香附多糖可有效改善肝纤维化大鼠肝脏功能、缓解肝脏纤维化程度，对于疾病的恢复具有重要意义。本研究病理学检查结果也显示，香附多糖处理组大鼠肝组织纤维化情况明显改善，证实了香附多糖可有效改善大鼠肝脏纤维化情况。然而，本研究仍存在香附多糖治疗的具体作用机制尚不明确等诸多问题，后期还应该对其进行深入研究。

综上所述，香附多糖对BSA所致的大鼠肝纤维化具有较好的防治作用，可有效改善大鼠肝脏功能，缓解肝纤维化程度，具有开发成为抗肝纤维化新药的潜力。

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