PEC HPI irp2基因缺失株的构建及蛋白结构功能预测

刘超英，吴程华，高 洪，严玉霖，富国文，赵 汝(云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201)

耶尔森菌强毒力岛(The Yersinia High-pathogeniticity island，HPI)主要含有与摄铁有关的毒力基因簇[1-3]。研究表明，耶尔森杆菌HPI不仅可以通过Ybt的铁载体夺取宿主中的铁元素进而加重机体的感染，而且可在耶尔森菌和E.coli之间水平传播，与致病性E.coli的毒力进化有着密切的关系[4]。irp2基因是HPI中主要的功能基因，在铁缺乏的条件下可表达高分子量蛋白(High Molecular Weight Protein 2，HMWP2)。高分子量铁调节蛋白参与表达耶尔森杆菌素的阳性表型，被认为对铁载体耶尔杆菌素的合成有着非常重要的作用。因此，致病性E.coli的irp2基因缺失株的构建对致病机制的研究至关重要。

大肠杆菌基因敲除的传统方法是利用其自身的RecA同源重组系统编码的RecA和RecBCD蛋白介导DNA的同源重组。但因该系统存在重组效率低等较多缺点，目前主要采用更为简单迅速的Red同源重组系统的方法进行基因敲除[5-6]。利用该方法构建致病性大肠杆菌(PathogenicE.coli，PEC)HPIirp2基因缺失株，不仅为HPI毒力致病机理研究提供技术基础和理论依据，也为大肠杆菌病的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 质粒pKD46、pKD4、pCP20购自优宝生物，5株E.coli(A-E)分离株由实验室分离鉴定保存。试剂及试剂盒主要包括离心柱型质粒小提试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、2×power Taq MasterMix、Competent Cell Preparation Kit、Phusion Flash High-Fidelity PCR MasterMix、FastDigest DpnI限制性内切酶等。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取和irp2基因的检测 利用细菌基因组DNA提取试剂盒的说明提取CVCC1565、E.coli(A-E)分离株培养液的DNA，产物保存在-20 ℃，作为PCR模版备用。根据irp2基因序列(GenBank登录号：L18881.1)的保守区域设计上下游引物，irp2-F(5'-3')：TTCCTTCAGCATCGCCTGTTA，irp2-R(5'-3')：CAAGCCCGACATACTCAATCT，由华大基因公司合成。以提取的DNA为模版，irp2-F/R为引物，进行PCR扩增。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72℃再延伸5 min。扩增结束后，经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，并在紫外灯下观察结果，拍照。选择E.coli(E)为试验对象，送硕擎公司进行irp2基因测序。

1.2.2 Red同源重组引物的设计 根据pKD 4序列GENEBANK(AY048743.1)设计引物扩增两侧带有FRT位点的卡那霉素抗性基因，在上下游引物5'端加入50 bp和45 bp的irp2基因的同源重组臂，同源重组引物为Q1/Q2(划线部分为同源臂)；根据pKD 46序列(GenBank登录号：AY048746.1)设计pKD46质粒鉴定引物bet-F/R；根据pCP 20序列(GenBank登录号：HB393402.1)设计pCP 20质粒鉴定引物FLP-F/R；敲除鉴定引物为A1、A2、B1、B2，引物由华大基因合成。引物序列见表1：

表1 同源重组所用引物Tab 1 Primers of homologous recombination

1.2.3irp2缺失株的构建 以质粒pKD 4为模板，Q1、Q2为引物进行PCR反应，制备打靶DNA片段。制作E.coli(E)细胞感受态，将pKD 46质粒转化后用特异性鉴定引物bet-F/R鉴定pKD 46阳性菌株，转化成功的菌株命名为E.coli(E)/pKD 46。过夜培养后制备E.coli(E)/pKD 46电转化感受态细胞并进行电转化，完成后取100 μL菌液涂布在LB固体培养基(卡那霉素终浓度为50 μg/mL)上，37 ℃培养过夜，然后使用鉴定引物A1、A2和B1、B2挑选卡那霉素抗性重组子(图1)。挑选含有Kan+和Amp+双抗性的阳性转化株通过FLP重组酶删除FRT位点之间的抗性序列。用鉴定引物A1、B2对卡那霉素消失的克隆进行鉴定。鉴定正确的菌种命名为E.coli(E)/Δirp2。

图1 PCR鉴定引物所在位置Fig 1 Scheme of priming sites

1.2.4 HMWP2蛋白结构及功能预测 利用测序得到的irp2基因序列，通过ExPASy开发的在线工具Protparam分析HMWP2的理论分子量和等电点(pI)；登陆http://www.predictprotein.org/，对HMWP2二级结构进行预测；使用ExPASy开发的在线工具ProtScale分析HMWP2的亲疏水性；使用ExPASy开发的在线工具TMpred分析HMWP2的可能的跨膜螺旋区，最优拓扑结构显示有9个跨膜螺旋；使用ExPASy开发的在线工具SWISS-MODEL，与已知结构的PDB数据库中的蛋白质序列进行比对，预测HMWP2的三级结构。

2 结果与分析

2.1E.coliirp2基因的PCR扩增E.coli(A-E)及阴性对照的PCR扩增结果如图2(M为2000 bp的DNA Marker；1为阴性对照，无条带；2-6为E.coli(A-E)irp2基因PCR扩增条带，与预期产物大小一致)。

图2 E.coli中HPI irp2基因的PCR检测Fig 2 PCR amplification of HPI irp2 gene of E.coli

2.2 打靶DNA片段的制备和纯化 用于替换irp2基因的打靶片段两端的同源序列分别为45 bp和50 bp，片段中间部分为两侧带有FRT位点的卡那霉素(Kan)抗性基因，有利于重组子的筛选。纯化回收的产物在高保真酶PCR扩增后经2%的琼脂糖凝胶电泳分析，与目的片段的大小一致，见图3(M为2000 bp的DNA Marker，1-3为同源重组DNA片段)。

图3 融合PCR构建的同源重组DNA片段Fig 3 DNA homologous recombination fragment builded by fusiohn PCR

2.3 质粒pKD 46转化E.coli(E)后的提取验证 将pKD 46转化导入到E.coli(E)中，挑选单个菌落在Amp+ LB液体培养基中进行扩大培养，提取质粒后进行电泳验证，转化的鉴定结果见图4(M为2000 bp的DNA Marker，1-3为鉴定结果)：

图4 质粒pKD 46转化的提取验证Fig 4 Extraction and Verification of Plasmid pKD 46

2.4 电转化后同源重组的鉴定 电转化后irp2基因被Kan抗性基因片段替换后，如图1所示，引物A1/A2、B1/B2和A1/B2分别用于扩增片段a、b、c。结果显示，有3个片段的长度和预计的一样(图5)，说明Kmr基因已经取代irp2基因，缺陷株E.coli(E)/Kmr+/Δirp2构建成功，正确重组率为10%。

图5 irp2基因敲除的PCR验证Fig 5 Verification of irp2 knockout by PCR

2.5 质粒pCP 20转化E.coli(E)/Kmr+/Δirp2后的提取验证 将质粒pCP 20转化导入缺陷株E.coli(E)/Kmr+/Δirp2，涂布于含Kan+和Amp+双抗性LB平板上，30℃培养筛选阳性转化子，挑选单个菌落在Amp+ Kan+ LB液体培养基中进行扩增，提取质粒后进行电泳验证，转化的鉴定结果见图6(M为2000 bp的DNA Marker，1-3为目的基因)。

图6 质粒pCP 20转化的提取验证Fig 6 extraction and verification of plasmid pCP 20

2.6 卡那霉素抗性基因的消除鉴定 将成功转化pCP 20的缺陷株E.coli(E)/Kmr+/Δirp2接种于无抗性的LB液体培养基中，42 ℃下传3～5代，再用卡那霉素抗性进行检测，卡那霉素抗性在能够稳定遗传的菌株中已经消除，命名为E.coli(E)/Δirp2。用鉴定引物A1、B2进行验证PCR和测序验证，如图7(M：DNA分子质量标准；1-3：目的基因)。

图7 卡那霉素抗性基因消除后PCR鉴定Fig 7 PCR analysis after kanamycin resistance gene eliminated

2.7 HPIirp2基因表达的蛋白的预测分析

2.7.1 HMWP2分子量及等电点的预测分析 使用ExPASy开发的在线工具Protparam分析HMWP2的理论分子量和等电点(pI)分别为：228826.60 Da，5.85。

2.7.2 HMWP2 二级结构的预测分析 登陆http://www.predictprotein.org/，对HMWP2二级结构进行预测，二级结构中α螺旋、β折叠和无规则卷曲所占的百分比分别为：43.5%、10.76%、46.19%，如图8。

图8 HMWP2二级结构预测Fig 8 Prediction of HMWP2's Secondary Structure

2.7.3 HMWP2亲疏水性分析 使用ExPASy开发的在线工具ProtScale分析HMWP2的亲疏水性。结果显示总平均疏水指数为：-0.221，为疏水性蛋白，如图9。

图9 HMWP2疏水性预测Fig 9 Prediction of HMWP2's Hydrophobicity

2.7.4 HMWP2跨膜区分析 使用ExPASy开发的在线工具TMpred分析HMWP2的可能的跨膜螺旋区，最优拓扑结构显示有9个跨膜螺旋，如图10。

图10 HMWP2跨膜螺旋预测Fig 10 Prediction of HMWP2's Transmembrane Helices

2.7.5 HMWP2三级结构的预测分析 使用ExPASy开发的在线工具SWISS-MODEL，与已知结构的PDB数据库中的蛋白质序列进行比对，来预测HMWP2的三级结构，结果如图11。

图11 HMWP2三级结构预测Fig 11 Prediction of HMWP2's Tertiary Structure

3 讨论与小结

1998年，Murphy[7]首次报道了将λ噬菌体的exo、bet、gam三个重组功能基因在质粒上进行表达，从而利用λ噬菌体的Red功能在E.coli染色体上进行基因替换。与RecA同源重组体系相比，由于Red重组发生在细胞内，E.coli的复制和修复系统保证了克隆的子代分子完全忠实于亲代分子[8]。Red同源重组系统是由λ噬菌体的分别编码Exo、Beta、Gam三种蛋白质的exo、bet、gam三个基因组成的。Exo蛋白是一种单亚基分子量为24 kD的核酸外切酶，它的活性形式是一种环状的三聚物分子，中间有一个一端能容纳双链DNA(dsDNA)，另一端能容纳单链DNA(ssDNA)的中空通道[9]。Exo蛋白可以结合在dsDNA的末端，从双链DNA从5'端向3'端降解，从而产生3'端突出。Beta蛋白是一种单亚基分子量为25.8 kD的退火蛋白，它可以通过自发地形成环状结构而结合到由Exo降解产生的ssDNA的3'突出端，从而促进ssDNA末端与互补链之间的退火，同时Beta蛋白还能防止单链核酸酶降解外源线性DNA[10]。Gam蛋白是Exo和Beta的辅助蛋白，功能是防止外源DNA片段被降解掉[11]。

目前用的最多的Red重组质粒是Datsenko[12]构建的具有高效重组能力的的低拷贝质粒pKD 46。pKD 46在30℃培养时能够正常地复制，当温度高于37 ℃时质粒自动丢失，它含有温敏型的复制起点oriR101和受ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因[13]，这三个基因携带氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记，在L-阿拉伯糖的诱导下表达。pKD 4在Red同源重组系统中作为抗性标记使用，它含有卡那霉素抗性基因，以及在抗性基因的两侧有FRT位点。pCP 20同时含有氨苄青霉素和氯霉素抗性，且含有温敏型的复制起点。pCP 20上还含有一个能产生与FRT位点结合的翻转酶重组酶(Flipase Recombination Enzyme，FLP)的基因，从而使FRT位点发生自身同源重组，消除一个FRT位点和抗性基因。FLP重组酶可以在42 ℃时诱导表达，同时质粒逐渐丢失[12,14]。

HPI是耶尔森菌的一个基因组，含有11个基因的功能核心区，携带的基因与铁载体—耶尔森杆菌素的合成、调节和转运有关。其中，irp2基因为HPI的标志基因，与摄铁功能相关，该基因表达的HMWP2蛋白对Ybt的合成具有重要作用，被认为是Ybt阳性表型表达所必需。预测结果表明，HMWP2蛋白在pH为5.85时溶解度最小，易于析出。其中α螺旋、β折叠和无规则卷曲所占的百分比分别为43.5%、10.76%和46.19%，HMWP2蛋白为疏水性跨膜蛋白。这些性质可能与该蛋白的摄铁转运相关。irp2作为铁调节基因，仅在致病性耶尔森菌中表达，编码的分子量为228 KD的HMWP2蛋白可参与Ybt的合成，诱导鼠疫菌素受体和Ybt表达，与耶尔森菌的铁摄取能力有关。试验利用Red同源重组的方法对irp2基因进行了敲除，并通过测序，对irp2基因表达的HMWP2蛋白进行了结构及功能预测，不仅为研究irp2基因在PEC致病机制中的作用及Red重组系统研究HPI的其他基因奠定了基础，也为制备肠道感染病疫苗和粘膜免疫佐剂等提供了更多的理论依据。

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