不同频率电刺激诱导长时程痛觉敏化的分析比较*

夏威威 朱震奇 王凯丰 刘海鹰

(北京大学人民医院脊柱外科，北京 100044)

长时程增强(long-term potentiation, LTP)被认为是中枢神经系统突触可塑性的一个重要特征，并且也被认为是在脊髓痛觉传导通路中导致疼痛敏化的一个重要机制[1,2]。脊髓部位突触发生的LTP在中枢敏化(central sensitization)的诱导中起到了很重要的作用，中枢敏化被认为是急性的术后疼痛和由一些由初始的疼痛事件引起的慢性疼痛（如外周的炎症反应或神经病理改变）的一个重要原因[3]。尽管已经进行了大量的研究，但是仍然缺乏治疗疼痛的有效方法。因此，更进一步认识和研究疼痛形成的可塑性机制，对于改善慢性疼痛的治疗方案和防止疼痛慢性化具有重要意义。

有研究表明在动物及动物组织中，低频(1或 2 Hz)[4]、中频 (10 Hz)[4]和高频 (100 Hz)[5～7]条件性电刺激(conditioning electrical stimulation,CES)刺激C纤维后，均能够诱发其在脊髓背角浅层神经突触的LTP。在人体实验中，也可通过针形体表电极，应用CES诱发类似LTP的痛觉增强，但刺激频率最常用的为高频电刺激(100 Hz)，而低频电刺激会诱发类似长时程抑制(Long-term depression, LTD)的痛觉减弱[8]。然而在大部分的神经病理和炎症状态下，C纤维的痛觉感受器通常以1～10 Hz的低频方式自然放电，而不是国外学者实验中所应用的高频电刺激[9]。国内对于应用环形针形电极诱导长时程痛觉敏化也鲜有报道。另外不同的电刺激方式会可能会引起不同的神经因子和炎症介质的释放，进而引起不同的炎症反应和诱发中枢敏化[10]。然而使神经电刺激诱导长时程痛觉敏化的方式完全符合痛觉感受器不规律的自然放电过程是很困难的，而且难以实现其可重复性。

因此对于应用体表针形电极，采用条件性电刺激在人体诱导长时程痛觉敏化的方案仍需要进一步研究，以寻找到更为有效的电刺激频率，使得电刺激频率尽量接近于痛觉神经末梢在疼痛状态下的自然放电频率，进而建立更为合理和有效的长时程痛觉敏化模型。本研究首次加入中频(10 Hz)和更高频(200 Hz)的条件性电刺激，目的是通过比较三种不同的电刺激频率(10 Hz, 100 Hz 和200 Hz)，分析电刺激频率对于诱导长时程痛觉敏化的作用，并分析所有测量参数之间的相关性。本研究的实验假设为由于10 Hz更加接近痛觉感受器在炎症状态下的自然放电频率，因此可能会更加有效的诱导长时程痛觉敏化。

方 法

1. 受试者

20名健康受试者参加实验，其中10名男性，10名女性，年龄20～50岁，平均年龄28岁。排除标准：受试者实验部位之前或者现在有皮肤疾病，患有神经病理性疾病，患有慢性疼痛病史，滥用止痛药物及酗酒者，患有正在发生疼痛的疾病。所有的受试者在参加实验之前均签订知情同意书。

2. 条件性电刺激

恒定电流刺激器(DS5; Digitimer Ltd; UK)产生的经皮电刺激脉冲经过环形的针刺电极到达刺激部位，刺激部位位于肘横纹下方7 cm处，环形电极（直径:10 mm）是由15个针形阴性电极构成，每个阴性电极的直径是0.2 mm，突出于圆形基底1 mm，阴极的周围是环状的阳极，其内径是20 mm，外径是40 mm（见图1A）。这种电极被证实可以选择性刺激A-δ纤维和C纤维，由于阴极的直径非常小，可以在表皮层聚集大量电荷，而A-δ和C神经纤维主要分布于表皮层[10]。

条件性电刺激的方案包括：①电刺激频率为10 Hz，持续刺激50 s；②电刺激频率为100 Hz，刺激1 s，间隔9 s，重复5次；③电刺激的频率为200 Hz，刺激0.5 s，间隔9.5 s，重复5次。所有的条件性电刺激过程均持续50 s，共500 个方形电刺激脉冲，脉冲的波宽是1 ms。电刺激的强度是10倍的感觉阈值。感觉阈值的测量采用限制法，即一系列的电刺激脉冲会以上一个刺激脉冲强度的3%升高或降低电刺激强度，以受试者感觉到电刺激和电刺激感觉消失时记录所测得的电刺激强度作为感觉阈值，重复此过程三遍，取其平均值作为最终的感觉阈值。

3. 实验设计

每位受试者在参加正式实验之前会进行1次训练实验，以熟悉测量设备、疼痛感觉的分辨和评分问卷的使用。实验采用交叉实验设计，所有受试者均接受4次实验，包括3次不同频率条件性电刺激方案和一次无条件性电刺激空白对照实验（仅放置电极于右前臂），每次实验的时间间隔至少一周。皮肤痛觉评分和炎症反应在实施CES之前记录3次，在CES之后记录6次，时间间隔是10 min（见图1B）。皮肤痛觉的测定包括条件性电刺激部位对于单次电脉冲刺激的疼痛评分；电刺激周围部位对于不同重量针刺刺激和轻触刺激的痛觉评分。疼痛强度的评分采用视觉模拟评分法(visual analogue scale, VAS)，标尺刻度为0～100，其中没有任何感觉对应刻度“0”，疼痛阈值对应刻度“30”，能想象到的最疼的程度对应刻度“100”。

图1 实验设计 A. 实验装置：环形针刺电极放置在右侧前臂距离肘横纹远侧端7cm处，针刺觉刺激器(30 g和50 g)位于距离环形阴极15～20 mm的环形区域内(异位)，轻触觉的测量位于上下左右距离环形阴极15～20 mm的范围内（异位）。单次脉冲电刺激通过同一电极测量条件性电刺激部位的痛觉（同位）。B. 时间线：参数的测量包括皮肤炎症反应和痛觉的测量，所有的测量参数在条件性电刺激之前测量3次，之后测量6次，时间间隔10分钟。Fig.1 Study design A. Experiment set up. The pin electrodes were placed on the right forearm 7 cm distal to the cubital fossa. Pinprick stimulators (30 g, 50 g) were placed in an around area 15～20 mm to the cathodes(heterotopic). Light touch stimuli were done 15～20 mm to the cathodes in four directions (up, down, left,right)(heterotopic). The single electrical stimulation was applied using the same electrode (homotopic). B.Time line. The measurements included in fl ammation responses and pain ratings. All measurements were repeated three times before and six times after the CES with 10 min intervals.

4. 炎症性反应

条件性电刺激后局部皮肤的炎症反应包括皮肤血流及温度的变化。皮肤血流采用激光灌注成像仪(Full-Field Laser Perfusion Imager) (MoorFLPI; Moor Instruments Ltd, UK) 来评价电刺激后皮肤血流的变化情况。应用红外线成像仪 (Thermovision A40;FLIR; Sweden) 来测定电刺激后的皮肤温度变化。二者的变化可一定程度上反应外周组织在条件性电刺激之后的炎症反应变化。

5. 条件性电刺激部位的痛觉测定

在条件性电刺激部位进行单个方形脉冲的电刺激，其刺激强度是10倍的电刺激感觉阈值，电刺激脉冲的波宽是1 ms。受试者在接受刺激后对其进行VAS疼痛评分。此过程重复3次，取其平均值作为最终的痛觉评分（见图1A）。

6. 条件性电刺激部位周围的痛觉测定

在条件性电刺激部位的周围距离阴性电极15～20 mm的环形皮肤区域内测定针刺觉，针刺刺激器采用30 g和50 g（圆形尖端，直径0.2 mm）。受试者分别对30 g和50 g针刺刺激进行VAS痛觉评分（见图1A）。轻触觉的测定采用塑料杆医用棉签，在距离阴极上下左右四个方向15～20 mm的皮肤区域内，由外向内滑动棉签，棉签杆部略弯曲，滑动速度为1～2 cm/s。轻触刺激进行同上的VAS疼痛评分，结果取4次对轻触滑动刺激痛觉评分的平均值（见图1A）。

7. 统计学方法

采用双因素（电刺激频率和时间）的重复测量的方差分析对条件性电刺激后的皮肤血流和温度，异位的针刺感和轻触感，同位的单脉冲电刺激疼痛评分进行对比分析，电刺激频率因素和时间因素均为组内因素。对实验数据进行标准化，即条件性电刺激后的实验数据占刺激前的百分比。采用Greenhouse-Geisser纠正球形检验不通过。采用Bonferroni-Holm方法对多重比较进行校正。采用Pearson相关性分析法分析不同条件性电刺激后的测量参数间的相关性。结果表达采用均数±标准误(±SEM)。P ＜ 0.05被认为具有统计学意义。

结 果

1. 基线资料

测量后的条件性电刺激和同位的单个脉冲的电刺激强度是2.95±1.5 mA（感觉阈值×10；均数±标准差；n = 80），此电刺激强度高于90%的受试者（18/20）的疼痛阈值（30/100）。30 g针刺刺激器的平均疼痛评分为21±11（均数±标准差；n = 80），其刺激强度高于55%的受试者（11/20）的疼痛阈值(30/100)。50 g针刺感刺激器的平均疼痛评分为27±15（均数±标准差；n = 80），其刺激强度高于90%的受试者（18/20）的疼痛阈值(30/100)。棉签滑动的平均痛觉评分为6.8±4.3（均数±标准差；n = 80），其刺激强度均低于受试者的疼痛阈值(30/100)。在条件性电刺激之前，各测量参数的基线资料各组之间无统计学差异。在条件性电刺激之后，所有受试者均未出现肉眼可见的皮肤损害。

2. 皮肤炎症反应的比较

在皮肤血流的测量数据中发现在条件性电刺激频率和电刺激后的观察时间之间存在交互效应（重复测量的方差分析：F = 4.141, P ＜ 0.05）: 在10 Hz和200 Hz电刺激后10 min，皮肤血流高于对照期(t = 4.2, P = 0.001; t = 3.57, P = 0.003)；在 10 Hz电刺激后，10 min的皮肤血流量高于之后的任何时间点(P ＜ 0.05)，20 min的皮肤血流量高于60 min的血流量（t = 4.881, P = 0.004）；在200 Hz电刺激后，10 min的皮肤血流量高于之后的任何时间点(P ＜ 0.05)。在皮肤温度的测量中，我们发现测量部位的皮肤温度各组之间没有统计学差异，温度也没有随时间变化而变化，电刺激频率和观测时间点之间也没有发现交互效应。

3 条件性电刺激部位周围（异位）疼痛程度的比较

条件性电刺激部位周围的针刺感觉相比于对照期，在电刺激后疼痛程度均升高（重复测量的方差分析:条件性电刺激效应; 30 g: F = 13.94, P ＜ 0.01;50g: F = 10.19, P ＜ 0.01），但是三种不同频率的条件性电刺激期之间并没有发现统计学差别。30 g针刺疼痛值在条件性电刺激后逐渐升高（时间效应，F = 5.8, P = 0.002），升高到30 min后达到平台期（见图3A）。50 g针刺疼痛值在电刺激后高于对照期，并持续到实验结束（时间效应，F = 11.88, P ＜ 0.01）（见图3B）。条件性电刺激部位周围的轻触觉的感觉评分在电刺激后高于对照期（条件性电刺激效应，F = 10.51, P ＜ 0.05），并持续到实验结束，但未发现轻触觉的疼痛评分随时间而变化，三种不同频率的条件性电刺激期之间并没有发现统计学差别（见图3C）。

4. 条件性电刺激部位（同位）疼痛程度的比较

条件性电刺激部位对于单个脉冲电刺激的疼痛评分在各组之间没有发现统计学差异(重复测量的方差分析：F = 2.238, P = 0.114)。时间主效应发现有统计学意义（F= 7.0, P = 0.001）:在条件性电刺激后10 min的疼痛评分低于在30 min (P = 0.034)、40 min (P = 0.049)、50 min (P = 0.022)和 60 min(P = 0.009)的疼痛评分（见图3D）。在条件性电刺激频率和时间之间未发现有交互效应（F = 1.406,P = 0.227）。

5. 测量参数的相关性分析

图2 炎症反应(A)皮肤血流：皮肤血流在10 Hz和200 Hz条件性电刺激后均高于对照期，后逐渐下降。(B)皮肤温度：皮肤温度在各实验期之间无统计学差别，各时间点之间无统计学差别。Fig.2 In fl ammation responses(A) Super fi cial blood fl ow (SBF). SBF was found to be higher than the control session after 10 Hz and 200 Hz CES, then gradually declined. (B) Skin temperature (ST). ST was not found to be signi fi cantly different between sessions and between each time point.

图3 疼痛评分(A, B)针刺觉（30 g, 50 g）：针刺觉疼痛评分在三种CES后均高于对照期，并持续升高至观察结束。(C)轻触觉：轻触觉疼痛评分在三种CES后均高于对照期，并持续升高至观察结束。(D)单次脉冲电刺激：疼痛评分在CES呈现升高趋势，但在各实验期之间无统计学差异。Fig.3 (A, B) Pinprick sensation (30 g, 50 g). After CES, The pinprick pain ratings were higher than the control session and increased until the end of observation. (C) Light touch sensation. The light touch pain ratings were higher than the control session after CES and increased until the end of observation. (D) Single electrical stimulation (SES). The pain ratings to SES increased in the post-CES period, but no signi fi cant differences were found between sessions.

对条件性电刺激后的实验数据进行Pearson相关性分析，我们发现在各实验期（10 Hz, 100 Hz,200 Hz和对照）中，皮肤血流与皮肤温度的变化之间存在一定的相关性，二者的变化趋势是相似的（见图4）。皮肤血流和温度的变化与异位针刺痛觉（30 g和50 g）的变化没有发现相关性（见表1）。皮肤血流和温度的变化与异位轻触觉的变化在电刺激期未发现相关性，在对照期发现弱相关性（见表1）。同位的单次脉冲电刺激痛觉变化与皮肤血流和温度的变化之间在各条件性电刺激期未发现相关性，在对照期与温度变化之间发现弱相关性（见表1）。同位的单次脉冲电刺激痛觉变化与异位针刺痛觉（30 g和50 g）的变化在各实验期存在一定的相关性，二者的变化趋势是相似的（见图5）。同位的单次脉冲电刺激痛觉变化与异位轻触觉的变化在10 Hz和100 Hz实验期存在弱相关性。异位的针刺觉之间（30 g和50 g）在各实验期也发现具有一定的相关性。异位的轻触觉变化与针刺觉变化之间，在10 Hz、100 Hz和对照期中，发现具有一定的相关性（见表1）。

讨 论

图4 皮肤温度与血流之间的相关性。对照期(A)、10 Hz (B)、100 Hz (C)和200 Hz (D)实验期皮肤温度与血流之间的相关性。r: Pearson相关系数Fig.4 Correlations between skin temperature (ST) and superficial blood flow (SBF). Correlations between ST and SBF are shown in the control session (A), 10 Hz session (B), 100 Hz session (C) and 200 Hz session (D). r, Pearson' s correlation coef fi cient.

应用体表针形电极，通过条件性电刺激诱发类似中枢神经系统突触传递LTP的长时程痛觉敏化，其中一个关键因素就是选择合适的电刺激频率，以更有效的激动伤害性感受器。在神经病理性或炎症性疼痛状态下，C-纤维伤害性感受器持续的低频放电（1～10 Hz）诱发了痛觉过敏[11,12]。200 Hz已超过伤害性感受器的最大放电频率[13]，因此可能会存在脉冲的传导失败，即有些刺激脉冲没能通过突触传递到达神经中枢。低频的电刺激（如1 Hz）在动物实验中也可以诱导脊髓突触的LTP，但应用到人体实验中，所诱导的却是类似长时程抑制（Longterm depression, LTD）的痛觉减弱[4,8]，因此动物实验中诱导LTP的电刺激频率范围并非完全能够适用到人体的实验中，表明疼痛的变化并非是简单的单个神经突触的变化，可能是包括脊髓脑的上行和下行神经传导通路及其他神经调控机制综合作用的结果。以激活C-纤维的刺激强度刺激感觉神经纤维能够引起神经纤维中枢端释放谷氨酸，谷氨酸可以激活其N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体，这对于诱发LTP是非常重要的[1,14]。另外动物伤害性感受(Nociception)敏化的一个重要机制是在神经肽能C纤维和脊髓板层I (Lamina I) 有P物质(Substance P,SP)受体的神经元形成突触的部位发生LTP，这可能也是人类痛觉敏化的重要机制之一[1]。研究发现100 Hz和30 Hz的电刺激方式可同时引起SP和谷氨酸的释放，而持续低频(1 Hz)只能引起SP的释放，另外有发现间断高频电刺激(100 Hz)可以引起脑源性神经营养因子的释放[10]。但对于应用200 Hz CES促进何种神经及炎性分子的释放目前尚无文献报道。因此不同频率CES诱导痛觉敏化的过程可能涉及到了不同神经及炎性分子的释放。

本研究发现，三种不同频率CES刺激的皮肤部位的血流量增加，这是由于肽能伤害性感受器在受到刺激后发生轴突反射(Axon re fl ex)的结果，但我们发现三种频率电刺激对于皮肤血流量的影响是不一样的，这可能因为不同频率的电刺激对于肽能神经纤维的激动程度是不一样的，导致神经末梢不同程度地释放扩血管物质，其中激动的肽能神经纤维主要是C-纤维，能够分泌神经肽能物质，如SP和钙离子基因相关蛋白[15,16]。与100 Hz和200 Hz CES相比，10 Hz CES引起的皮肤血流量更高，持续时间也相对更长，这与Dusch的研究发现相一致，低频电刺激可以引起更大的炎症红斑 (Red fl are) 反应，这与机械刺激不敏感的C-纤维也被低频刺激激活有关[17]。并且有研究发现C纤维更容易倾向于被低频刺激激活，并在低频刺激下传导信号，其反应的时间也随刺激频率的增高而延长，因此相比于高频电刺激，10 Hz电刺激可能更能够有效的激活C-纤维伤害性感受器[18]。电刺激后的皮肤温度和对照期并没有区别，显示出皮肤温度并非评价电刺激后皮肤神经源性炎症反应的敏感指标。但本研究发现皮肤血流和温度之间发现具有相关性，二者的变化趋势是相似的，可能由于红外线成像所测的肢体温度受深部组织温度的影响比较大，进而无法准确的获取局部皮肤浅层的温度值。皮肤血流与同位（单次脉冲电刺激）及异位（针刺觉和轻触觉）的皮肤感觉变化没有相关性，表明外周神经末梢炎性导致的血流发展过程与痛觉改变的变化趋势是不同的，而引起血流变化的具体分子机制有待进一步研究。

表1 测量参数的相关性分析（r值，t值）Table 1 Correlations among measured parameters (r value, t value)

重复的刺激痛觉C-纤维会引起传导痛觉的突触传递效能增强，此过程也会导致传导非痛觉的A-β纤维和传导痛觉的A-δ纤维传导通路的易化，并因此分别产生了机械刺激的痛觉过敏 (Hyperalgesia)和痛觉超敏(Allodynia)[7]。有报道称TRPV1-阳性C-纤维和TRPV1-阳性A-纤维导致了异位的长时程痛觉敏化，但前者起主要作用；而TRPV1-阴性A-纤维主要参与介导继发性(Secondary)针刺痛觉过敏[19]。在本研究中，条件性电刺激周围部位的针刺痛觉和轻触觉在CES后升高，其原因可归结于异位的A-δ神经传导通路的易化，其中可能涉及到几项机制：①被易化的A-纤维传导通路与条件性C-纤维传导通路在脊髓同一神经元的汇聚是此现象能够发生的解剖学基础；②同时激动了谷氨酸能中间神经元，其导致了脊髓中痛觉传递神经元的敏化，另外起源于脑干的延髓头端腹内侧核的血清素能下行传导通路的易化可维持神经中枢的敏化[20]；③CES刺激部位及其周围的机械刺激非敏感“静默”痛觉感受器("Silent" nociceptor)也可能被条件性电刺激所激活[21]。外周神经的敏化也被认为是导致次级机械刺激敏化的一个重要原因，导致痛觉敏化的外周机制中一个重要的表现是神经源性的血管扩张，其中涉及一些神经肽能物质的释放[22,23]。这些神经肽能物质可以扩散到其它突触的受体，并兴奋临近神经元的机械刺激传导通路[15]。本研究发现皮肤血流与异位的针刺觉和轻触觉不存在相关性，说明外周机制可能并没有参与到异位长时程痛觉敏化的形成中，而且本实验中异位的机械刺激位置在很大程度上是位于皮肤血流变化范围之外的，以避免皮肤血流升高对于测量异位痛觉的影响，因此，异位痛觉敏化的主要原因考虑主要和神经中枢的敏化改变有关。本研究发现异位与同位的痛觉敏化存在一定相关性，提示二者的变化趋势是相似的，说明痛觉敏化的外周机制和中枢机制之间可能存在一定的协同关系。异位针刺觉和轻触觉之间在10 Hz和100 Hz存在一定相关性，提示A-δ和A-β纤维传导通路存在相似的易化趋势。

图5 针刺痛觉与单脉冲电刺激痛觉评分之间的相关性。对照期(A)、10 Hz (B)、100 Hz (C)和200 Hz (D)实验期针刺痛觉与单脉冲电刺激痛觉评分之间的相关性。r: Pearson相关系数。Fig.5 Correlations between pain ratings to pinprick stimuli and single electrical stimulation (SES). Correlations between pinprick stimuli and SES are shown in the control session (A), 10 Hz session (B), 100 Hz session (C) and 200 Hz session (D).r, Pearson' s correlation coef fi cient.

TRPV1-阳性C-纤维痛觉感受器在诱导同位长时程痛觉敏化中占主要地位，TRPV1-阴性C-纤维也同样会发生同位的自我易化[19]。本研究发现同位疼痛评分相比于对照期并没有升高，这与Klein的研究结果不同，他们研究发现，同位疼痛评分在CES之后高于对照组[7]，原因可能为：在于Klein的实验中，疼痛评分的测量间隔时间是2 min，而本实验的测量间隔时间是10 min，因此较长的时间间隔可能会遗漏疼痛随时间的变化。另外，van den Broeke在研究中发现，高频电刺激后，同位疼痛评分是降低的，尽管脑电记录的事件相关电位是增强的[24]。外周神经敏感化(Peripheral sensitization)是原发性(Primary)痛觉过敏的一个重要原因[1]，但在本研究中，皮肤血流的变化与单脉冲电刺激的疼痛评分之间未发现相关性。本研究未发现同位长时程痛觉敏化可能是由于：①LTP和LTD之间的拮抗作用，有研究表明在刺激A-δ纤维后出现痛觉的长时程抑制而不是敏化，因此条件性电刺激可能同时激动了C-纤维和A-δ纤维，进而发生了某种潜在的相互拮抗作用[2]；②另外由于在同一位置进行了大量重复的电刺激后，感受器产生了适应或者疲劳[25]；③在本研究中，由于需要重复测量炎症反应及皮肤感觉，刺激电极在前臂的位置需要每10 min移走和复位一次，因此可能导致测量皮肤感觉的位置存在一定程度的偏差，从而可能掩盖了同位长时程痛觉敏化的存在。

本研究发现10 Hz和200 Hz的电刺激方案同样可以引起异位的长时程痛觉敏化；电刺激引起的皮肤血流的变化与异位针刺觉、轻触觉和同位的痛觉变化不存在相关性，但同位的痛觉变化和异位的痛觉变化存在一定相关性，异位针刺觉变化和轻触觉变化之间存在一定相关性。条件性电刺激诱导长时程痛觉敏化反映出痛觉传导通路的神经可塑性。由于10 Hz电刺激频率更接近于炎症和神经病理性疼痛的痛觉神经末梢的放电频率，所以此长时程痛觉敏化模型可被建议应用到相关的疼痛研究中。

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