混合脱钙液与EDTA脱钙液对骨组织切片HE染色影响的分析

吴拮　孙立国　赵成相

摘要：目的 比较不同脱钙液对骨组织的脱钙能力的差异，探讨其对HE染色的影响。方法 选取16例大鼠胫骨标本，运用两种常用的脱钙液（混合脱钙液和EDTA脱钙液）进行脱钙，比较其脱钙效果和对HE染色的影响。结果 两种脱钙液对骨组织的脱钙能力、HE染色效果影响有显著区别。结论 混合脱钙液时间最短，但切片和染色效果最差；EDTA脱钙液对骨组织损伤小，HE染色效果最好，但用时较长。

关键词：混合脱钙液；EDTA脱钙液；HE染色

中图分类号：R361 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）26-0180-02

Abstract：Objective To compare the difference of different decalcifying fluid on bone decalcification ability，and to investigate its effect on HE staining.Methods 16 cases of rat tibia specimens， using two kinds of decalcifying fluid（mixture of decalcifying fluid and EDTA decalcifying fluid） were decalcified，compare the decalcification effect and the effects on HE staining.Results Two decalcification of bone tissue decalcification ability， HE staining effect has significant difference.Conclusion Mixed decalcifying fluid in the shortest time，but the sectioning and staining effect is the worst；EDTA decalcification of bone HE staining had the best effect，but with a longer time.

Key words：Mixed decalcification solution；EDTA decalcification liquid；HE staining

骨组织是一种坚硬的结缔组织，由骨细胞和骨基质组成。骨基质内含大量无机盐，质地坚硬，不能直接进行石蜡或冷冻切片，因此在制作病理切片过程中，常常需要经过脱钙处理，才能进行切染色[1]。试验中脱钙过度或不足会影响染色效果，严重影响结果的判读，因此，脱钙时间和脱钙液的选择十分重要。为了更好地了解脱钙技术对骨组织切片HE染色结果的影响，本文重点对比SD大鼠胫骨上段骨组织通过两种不同脱钙液的脱钙以及HE染色效果进行对比，现报告如下。

1材料与方法

1.1 材料与仪器

标本为第四军医大学西京医院骨科动物实验中心提供的大鼠8只。取双侧胫骨上端16例标本，长约0.8 cm，用纱布包好随机标记为A组和B组，在10%中性福尔马林固定3 d，投入脱钙液中，A组为EDTA脱钙液，B组为混合脱钙液。仪器：雅博全自动脱水机；德国Leica石蜡切片机，Thermo全自动染色机。

1.2脱钙液配制

A组：EDTA186g加蒸馏水至1000 ml，加NaOH搅拌溶解调节至pH8.0。B组：蒸馏水360 ml，依次加入氯化钠4.5 g，结晶氯化铝30 g搅拌溶解，再加入盐酸40 ml，甲醛50 ml，冰醋酸12.5 ml，甲酸35 ml搅拌混匀。

1.3方法

1.3.1脱钙及脱钙终点标本用两种不同脱钙液在常温通风下进行脱钙，每间隔3 d更换一次脱钙液，当用手术缝针轻松無阻力穿过组织或可用手术刀轻力切开即为脱钙完成。A组流水冲洗30 min后脱水石蜡包埋。B组脱钙完成后，流水冲洗12 h以上后脱水石蜡包埋。包埋好的蜡块，利用Leica石蜡切片机切片，切片厚度为6 um，即可进行HE染色。

1.3.2脱水染色HE染色石蜡切片常规脱蜡至水，置于苏木精染液10 min，水洗2 min，用1%盐酸乙醇分化15 s，水洗2 min，稀氨水返蓝1 min，水洗2 min，80%乙醇1 min，伊红2 min，水洗1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封固。

2结果

2.1脱钙时间

EDTA脱钙液脱钙时间长，约3 w。混合脱钙液脱钙时间短，约1 w。

2.2组织损伤程度

EDTA脱钙液对骨组织损伤小，标本脱钙均匀完全，不破坏组织细胞细微结构。混合脱钙液脱钙比较完全，但不均匀，切片局部有面粉样组织，对骨组织损伤大，破坏组织结构。

2.3染色效果

EDTA液脱钙脱钙后，切片完整，HE染色均匀，颜色鲜艳，细胞核着色清晰，见图1、图2。混合脱钙液脱钙后，切片不完整，且有刀痕，部分有掉片或重叠现象，HE染色欠鲜艳，细胞核颜色为深黑色，结构欠清晰，见图3、图4。

3 讨论

脱钙是利用化学或物理方法，将骨组织中的钙盐和胶原纤维进行分离“除去钙盐”。使骨组织软化，目的是获得完整的骨切片。常用的脱钙剂主要抱括单纯酸类、混合酸类、螯合剂等[2]。选择脱钙液是制作骨切片的重要环节，即要切出完整的切片，又要能完整的保存骨组织内部成分的完整性。对组织内的酶、抗原都有一定保护作用。

目前有两种脱钙液应用多年，即混合脱钙液和EDTA脱钙液。混合脱钙液目前临床使用最广，主要是因为其脱钙能力强，脱钙时间短，但这也使得骨组织的脱钙程度较难掌握，往往造成过度脱钙[3]。同时，它参透能力差，对骨组织特别是比较硬的骨组织渗透能力更差，出现脱钙不均匀，部分标本切片出现“返砂”现象，制片易出现“刀痕”，影响观察。而脱钙时间长对骨组织的酶类物质、抗原等又有一定的破坏性，对组织损伤大，容易破坏细胞结构的完整性，切片时易散碎，染色欠清晰，影响染观察[4-5]。endprint

随着医学研究的发展对组织学制作提出更高的要求，混合脱钙液越来越不适应发展的要求。而EDTA脱钙液能与钙形成一种可溶性非离子化的复合物，pH接近中性时可发生螯合作用。EDTA的优越性在于骨组织不会被气泡破坏，而且脱钙后染色酶不会被破坏，分化好，因此可用作骨组织相关酶类组织化学的研究。另外，EDTA是一种作用缓慢的脱钙剂，需要作用时间较长，故适用非速检标本。它的脱钙作用很强，除钙质外，组织中的其它金属如铁、镁、铝等亦能被除去[6-8]。

本实验中由于胫骨组织具有皮质骨硬，骨小梁易断的特点，如果脱钙不彻底可导致切片破碎、裂断。实验中用EDTA脱钙液，脱钙均匀，切片完整，染色鲜艳，着色效果好，保持良好细胞细微结构，尤其是对免疫组化染色，能保存细胞的抗原性和部分酶类的活性。

在整个制作过程中应注意以下几点：①取材时骨组织块不易过厚，一般在6 mm左右，以免脱钙时产生过长影响染色效果；②脱钙液要充足，一般为标本体积的20倍，换脱钙液1次/2 d；③脱钙时将瓶口不要盖严，在通风处放置，这样会缩短脱钙时间；④切片时刀要锋利，最好是一次性刀片，不要有划痕；⑤染色时特点注意水洗步骤，流水冲洗时不要对着组织冲洗，以免脱片[9]。

参考文献：

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编辑/李樺endprint