泛耐药鲍曼不动杆菌β—内酰胺类抗菌药物耐药机制研究

鲍群丽　汪宏良　柯俊

摘要：目的 探讨一组泛耐药鲍氏不动杆菌β-内酰胺类抗菌药物耐药机制。方法 收集2015年1月～6月湖北省黄石市中心医院（A）住院患者中分离的20株泛耐药鲍氏不动杆菌，用mdfA测序确认菌种，再采用聚合酶链反应（PCR）法分析32种β-内酰胺类药物获得性耐药基因、1种膜孔蛋白carO基因、1种获得性外排泵adeB泵蛋白基因。结果 20株泛耐药鲍氏不动杆菌共检出4种β-内酰胺类获得性耐药基因，A类β-内酰胺酶基因TEM、C类β-内酰胺酶基因ADC、D类β-内酰胺酶基因OXA-23、OXA-51，四者阳性率均为100.00%；B类β-内酰胺酶基因未检出；膜孔蛋白carO基因缺失率为100.00%，外排泵adeB基因阳性率为95.00%。结论 泛耐药鲍氏不动杆菌中携带的耐药基因和耐药表型相对应，对β-内酰胺类药物耐药与产TEM、ADC、OXA-23、OXA-51β-内酰胺酶基因，膜孔蛋白carO基因缺失和获得外排泵adeB3种耐药机制有关。

关键词：鲍氏不动杆菌；β-内酰胺酶基因；膜孔蛋白基因；外排泵adeB基因；泛耐药

中图分类号：R446.5；R450 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）26-0031-04

Abstract：Objective To investigate the drug resistance mechanism of a group of Pan-drug-resistant Acinetobacter baumannii β-lactam antibiotics. Methods 20 strains of Pan-drug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from hospitalized patients in central hospital of Huangshi（A） in Hubei province from January to June 2015 were collected.The strains were confirmed by mdfA sequencing，and then polymerase chain reaction（PCR） The results showed that there were 32 β-lactam drug resistance genes， 1 membrane pore protein carO gene and 1 adaptive efflux pump adeB pump gene.Results 20 strains of pan-resistant acinetobacter baumannii were detected four kinds of β-lactam acquired resistance genes，class A β-lactamase gene TEM，C-type β-lactamase gene ADC，D-type β-lactamase gene OXA-23，OXA-51，the four were 100.00% positive rate；The amidase gene was not detected；membrane hole protein carO gene deletion rate was 100.00%，efflux pump adeB gene positive rate was 95.00%.Conclusion The resistance genes and drug resistance phenotypes carried by the drug-resistant acinetobacter baumannii strains correspond to β-lactam drug resistance and the production of TEM，ADC，OXA-23 and OXA-51β-lactamase genes，deletion of membrane pore protein carO gene and efflux pump adeB3 resistance mechanism.

Key words：Acinetobacter baumannii；β-lactamase gene；Membrane porin gene；Efflux pump adeB gene；Pan-drug resistance

繼临床分离到多药耐药的鲍氏不动杆菌（MDRAB）后，更严重的泛耐药鲍氏不动杆菌（XDRAB）与全耐药鲍氏不动杆菌（PDRAB）在国内外都有分离报告[1-5]。为全面了解XDRAB β-内酰胺类抗菌药物耐药机制，我们对分离自湖北省黄石市中心医院20株XDRAB进行了13种A类β-内酰胺酶基因、10种B类β-内酰胺酶基因（金属β-内酰胺酶）、2种C类β-内酰胺酶基因（AmpC酶）、8种D类β-内酰胺酶基因和膜孔蛋白carO基因以及外排泵adeB基因检测，现报道如下。

1资料与方法

1.1 一般资料

20株XDRAB均分离自2015年1月～6月我院住院患者各种标本鉴定的菌株，每位患者一株菌。

1.2 菌种鉴定和药敏试验

全部XDRAB经鲍氏不动杆菌种特异基因mdfA检测确认。药敏试验采用K-B纸片琼脂扩散法测定菌株对抗菌药物的抑菌环直径。药敏纸片为英国Oxoid公司产品，培养基为法国生物梅里埃公司产品，结果判断按美国临床实验室标准协会（CLSI）2013版执行。

1.3 细菌DNA制备

蛋白酶K水解离心快速裂解法。挑纯培养菌落置0.5 ml离心管内（内预置200 ng/ml蛋白酶K溶液400 μl），56 ℃水浴2 h，改95 ℃水浴10 min，即为基因检测模板液，-20 ℃冰箱保存。endprint

1.4 基因检测

20株XDRAB耐药元件检测项目：32种β-内酰胺酶编码基因（blaTEM、blaSHV、blaKPC、blaCTX-M-1群、blaCTX-M-2群、blaCTX-M-8群、blaCTX-M-9群、blaCTX-M-25群、blaPER、blaVEB、blaGES、blaCARB、 blaRTG、blaIMP、blaVIM、blaDIM、blaSIM、blaSPM、blaGIM、blaAIM、blaNDM、blaKHM、blaTMB、blaDHA、 blaOXA-1群、blaOXA-2群、blaOXA-10群、blaOXA-20群、blaOXA-23群、blaOXA-24群、blaOXA-51群、 blaOXA-58群）、1种膜孔蛋白carO编码基因以及获得性外排泵泵蛋白adeB编码基因，检测均为PCR法。基因引物识别序列和目的产物长度，见表1。上述参数、靶基因全部PCR引物序列由无锡新区虎马生物信息学工作室设计并获授权使用，商品化基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

1.5 样本聚类分析

测得结果作样本聚类分析（UPGMA法）。样本聚类分析由无锡新区虎马生物信息学工作室完成

2结果

2.1基因检测结果

20株XDRAB经32种β-内酰胺酶基因检测，均检出A类β-内酰胺酶基因TEM、C类β-内酰胺酶基因ADC、D类β-内酰胺酶基因OXA-23，OXA-51，即TEM、ADC、OXA-23，OXA-51阳性率均为100.00%，B类β-内酰胺酶基因未检出。20株XDRAB膜孔蛋白carO基因缺失率100.00%，檢出外排泵adeB基因，阳性率为95.00%，见表2。

2.2 阳性耐药基因电泳图

阳性耐药基因（TEM、OXA-23、carO、ADC、adeB、OXA-51）PCR电泳图，见图1。

2.3 耐药元件样本聚类分析

A-黄石市中心医院，A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20代表20株细菌，见图2。

3讨论

我院临床分离的20株泛耐药鲍氏不动杆菌中，12株来源于重症监护病房，8株来源于神经外科病房，这可能与多种因素相关：如各种侵入性操作如气管插管、导尿管的使用；导管留置时间延迟；患者免疫功能低下；细菌变异；抗菌药物不合理使用等，应引起临床医护人员高度重视，避免暴发性医院感染的发生。

导致革兰阴性杆菌β-内酰胺类抗菌药物耐药的机制主要有：①产β-内酰胺酶，并释放到革兰阴性杆菌周质空间，灭活经外膜膜孔流入的β-内酰胺类药物，β-内酰胺酶按酶蛋白序列聚类可分为A、B、C、D4类。②革兰阴性杆菌外膜膜孔蛋白缺陷，导致β-内酰胺类抗菌药物进入减少或无法进入。③革兰阴性杆菌内膜上的外排泵蛋白编码基因突变，导致外排β-内酰胺类药物能力増强或额外获得外排泵。④青霉素结合蛋白各种亚单位编码基因突变，突变导致PBPs构象改变，β-内酰胺类药物与构象改变的PBPs结合力下降而耐药。尽管国内对耐β-内酰胺类抗菌药物鲍氏不动杆菌已有较多β-内酰胺酶基因检测报道，但同时涉及膜孔蛋白carO基因和外排泵adeB基因的报道较为少见[6-8]。

本研究20株XDRAB检出TEM、ADC、OXA-23、OXA-51阳性率均为100.00%。B类金属β-内酰胺酶基因未检出。本研究作了10种B类β-内酰胺酶基因检测，包括新型金属β-内酰胺酶AIM、KHM、TMB、IMP、VIM等均为阴性。carO基因编码鲍氏不动杆菌碳青霉烯类药物特异性膜孔蛋白carO[9-11]。本组20株XDRAB膜孔蛋白carO基因缺失率达100.00%， 阳性耐药基因PCR电泳图。

细菌的外排泵系统可分为5大类：耐受-生节-分裂家族（RND）、多药物与毒物外排家族（MATE）、药物与代谢物转运体超家族（DMT）及与之相关的小多药外排家族（SMR）、ATP结合转运体家族（ABC），除ABC为能量泵外，其余均为质子泵[12-13]。adeABC外排泵系统外排β-内酰胺类药物、氨基糖苷类药物、红霉素、氯霉素、四环素[14-16]。adeB基因为ade ABC外排泵泵蛋白的编码基因。由实验可见，本组PDRAB对头孢类药物（包括碳青霉烯类药物）均耐药，与产TEM、ADC、OXA-23、OXA-51β-内酰胺酶，膜孔蛋白carO基因缺失和获得ade B 外排泵3耐药机制相关。

本研究分离菌株耐药元件检测结果的样本聚类分析可见， A院20株XDRAB分不同的簇群，由二个克隆传播，A院的A1- A2-A3-A4-A5-A6-A7-A9-A12-A14-A15-A16-A17-A19-A20等15株为同一克隆，构成大暴发，A8-A11-A18等3株亦为同一克隆。本研究提示，XDRAB应引起足够的关注，它们携带的获得性耐药基因可能会加剧其它革兰阴性杆菌的耐药性，因此加强医院感染控制的措施是必须的。

参考文献：

[1]Kim Y，Bae IK，Jeong SH，et al.In Vivo Selection of Pan-Drug Resistant Acinetobacter baumannii during Antibiotic Treatment[J].Yonsei Med J，2014，56（4）：928-934.

[2]Ning F，Shen Y，Chen X，et al.A combination regimen of meropenem，cefoperazone-sulbactam and minocycline for extensive burns with pan-drug resistant Acinetobacter baumannii infection[J].Chin Med J（Engl），2014，127（6）：1177-1179.endprint

[3]Zarrilli R，Di Popolo A，Bagattini M，et al.Clonal spread and patient risk factors for acquisition of extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii in a neonatal intensive care unit in Italy[J].J Hosp Infect，2012，82（4）：260-265.

[4]Metan G，Pala C，Kaynar L，et al.A nightmare for haematology clinics：extensively drug-resistant（XDR）Acinetobacter baumannnii[J].Infez Med，2014，22（4）：277-282.

[5]Teo J，Lim TP，Hsu LY，et al.Extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii in a Thai hospital：a molecular epidemiologic analysis and identification of bactericidal Polymyxin B-based combinations[J].Antimicrob Resist Infect Control，2015，4（1）：2.

[6]王卫华，陈洁，李春仙，等.泛耐药鲍氏不动杆菌β-内酰胺酶、膜孔蛋白、外排泵编码基因研究[J].中华医院感染学杂志，2012，22（10）：2001-2004.

[7]许小敏，蔡培泉，胡锡浩，等.兩所三级医院耐药鲍氏不动杆菌耐药元件检测研究[J].中华医院感染学杂志，2015，25（18）：4092-4095.

[8]许亚丰，耿先龙，王春新，等.多重耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶、膜孔蛋白及β-内酰胺类靶位编码基因研究[J].中国抗生素杂志，2014，39（1）：58-64.

[9]张建明，金跃，糜祖煌，等.耐药鲍曼不动杆菌中发现β-内酰胺酶ADC基因和膜孔蛋白carO基因新的变异型[J].中华检验医学杂志，2013，36（3）：255-257.

[10]和平，刘原，潘双，等.耐亚胺培南鲍氏不动杆菌carO基因表达的研究[J].中华医院感染学杂志，2013，23（14）：3301-3304.

[11]陈刚，茹纳丹，翁幸鐾.耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌β-内酰胺酶与膜孔蛋白carO、oprD基因研究[J].中华医院感染学杂志，2014，24（15）：3641-3644.

[12]王友梅.鲍曼不动杆菌耐药性分析及碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌外排泵机制研究[D].安徽医科大学，2012.

[13]刘红丹，徐文思，张慧宇，等.消化科住院患者医院感染鲍曼不动杆菌外排泵系统机制研究及耐消毒剂基因检测分析[J].中国病原生物学杂志，2016，11（10）：943-946.

[14]张海云，韩伟东，刘海梅，等.多药耐药鲍氏不动杆菌外排泵耐药基因及同源性分析[J].中华医院感染学杂志，2015，25（7）：1444-1447.

[15]潘红超，商安全，张康见.亚胺培南耐药的鲍氏不动杆菌OXA、AdeABC、carO基因及生物膜的研究[J].中华医院感染学杂志，2016，26（20）：4572-4575.

[16]潘红超，商安全，刘晓明，等.生物膜形成促进临床耐亚胺培南鲍曼不动杆菌OXA-23和AdeABC外排泵基因的表达[J].现代预防医学，2017，44（1）：155-159.编辑/李桦endprint