ERα基因单核苷酸多态性与乳腺癌应用芳香化酶抑制剂引发骨丢失的相关性研究

2018-03-12 01:26:36殷玉莲张卫红叶媚娜陈红风
实用肿瘤学杂志 2018年1期
关键词:等位基因多态性基因型

殷玉莲 张卫红 周 悦 叶媚娜 陈红风

乳腺癌是威胁当代女性身心健康的常见恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势[1]。流行病学研究显示,乳腺癌患者中逾六成为激素受体(Hormone receptor,HR)阳性[2],针对HR阳性的乳腺癌患者,内分泌治疗是常见的治疗方式。其中,芳香化酶抑制剂(Aromatase inhibitor,AI)已经成为绝经后激素受体阳性乳腺癌的常见内分泌治疗药物。但在提高患者生存率的同时,AI治疗会带来骨代谢异常、全身骨关节酸痛、骨质疏松,甚至骨折等不良结局,这一系列变化被称为芳香化酶抑制剂相关性骨丢失(Aromatase inhibitors-associated bone loss,AIBL)。在临床实践中,同期应用AIs治疗的乳腺癌患者,其骨密度、骨代谢指标表现参差不齐。已有研究证实,健康人群中女性骨代谢异常发生风险与ERα(Estrogen receptor alpha)第一内含子上2个位点(rs9340799、rs2234693)的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)有关[3-5]。另有研究结果表明这2个位点SNPs与乳腺癌发生风险存在关联[6],但与AIBL发生风险的相关研究较少。因此,本研究将探索rs9340799、rs2234693位点SNPs与AIBL的相关性,试从中筛选出AIBL易感的基因类型,以尽早预防AIBL的发生并为绝经后乳腺癌患病群体的精准治疗提供新依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

所有病例来自上海中药大学附属龙华医院中医乳腺科2015年10月—2017年4月期间门诊及住院的乳腺癌术后应用芳香化酶抑制剂治疗(≤2年)、未合并其他恶性肿瘤、无家族史、否认合并用药、签署知情同意书的绝经后患者。患者平均年龄为58.56±6.81岁;平均绝经时间为9.42±5.50年,绝经时间≤10年、>10年的分别为67例和49例;接受AIs治疗<1年、1~2年的分别有72例和44例;其中使用来曲唑51人,阿那曲唑34人,依西美坦31人。

1.2 ERα基因SNPs位点检测

所有入组对象均抽取清晨空腹外周静脉血2 mL,将其置于无菌无酶的EDTA抗凝试管,存放于-20℃环境。引物均由生工生物工程(上海)有限公司设计并合成。对目标片段进行PCR扩增[7],ERα基因PCR产物琼脂糖电泳观察图见图1。

图1 ERα基因PCR产物琼脂糖电泳观察图Figure 1 PCR product of ERα by the agarose electrophoresis

1.3 引物设计及基因位点测序方法

引物均由生工生物工程(上海)有限公司设计并合成,如下:rs9340799-F 5′TTGTTATTTTTTTGACACATGTTCT3′;rs9340799-R5′ AAAATGACAAAATGAAATTAGCTG3′214反向测序;rs2234693-F5′ ATCCAGGGTTATGTGGCAAT3′;rs2234693-R5′ CTAATAGACTTAATGTTTTTGCAGG 3′ 222反向测序。基因位点测序仪型号为3730XL(美国ABI),结果使用Seqman以及Chromas软件进行分析,2位点的测序图见图2。

图2 ERα基因位点测序图Figure 2 ERα gene site sequencing mapNote:A.rs9340799 site;B.rs2234693 site.

1.4 骨密度测定

采用双能X线吸收法测量腰椎(L1-L4)、股骨BMD,按常规腰椎、股骨检测条件及体位,并对年龄、BMI指数等影响BMD的因素进行修正。每日开机后均用模体校正,错误率为0.5%,常年错误率<1%。

1.5 统计方法

应用SPSS 21.0统计软件进行统计分析,采用PLINK-doc-1.04对患者测序结果进行Hardy-Weinberg遗传基因分布平衡检验。各基因亚型组间的计量和计数资料差异比较采用方差分析和卡方检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ERα基因rs9340799、rs2234693位点基因型和等位基因分布

116例乳腺癌术后应用AIs治疗的患者中,ERα基因rs9340799位点,A、G等位基因的分布频率分别为79%和21%;其中A/A型实际频数76例,A/G型32例,G/G型8例(P>0.05)。ERα基因rs2234693位点中C、T等位基因的分布频率为34%和66%;其中C/C型实际频数为17例、C/T型为45例、T/T型为54例(P>0.05),说明样本具有群体代表性(表1)。

表1 ERα基因rs9340799、rs2234693位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验

2.2 ERα基因rs9340799、rs2234693位点SNPs与腰椎BMD的关系

比较ERα基因rs9340799位点各基因型患者间腰椎BMD的差异,发现该位点的3种基因型(A/A、A/G、G/G)组间腰椎BMD值差异具统计学意义(P<0.05);在A显性模式下,即A/A、A/G基因型患者腰椎BMD(0.935±0.126 g/cm2)、(0.901±0.119 g/cm2)均高于G/G基因型患者(0.847±0.153 g/cm2)(P<0.05)。而该位点3组基因亚型的腰椎T值之间的差异比较无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 ERα基因rs9340799位点SNPs与腰椎BMD值和T值的关系

Note:When *P<0.05,compared to G/G.

比较另一ERα基因rs2234693位点各基因亚型患者间腰椎BMD的差异,发现该位点3种基因型(C/C、C/T、T/T)组间腰椎BMD值差异具有统计学差异(P<0.05);在T显性模式下,即T/T、C/T基因型的腰椎BMD(0.929±0.116 g/cm2)、(0.916±0.134 g/cm2)均高于C/C基因型患者(0.878±0.139 g/cm2)(P<0.05);但T/T型与C/T型的患者腰椎BMD无统计学差异(P>0.05)。且该位点3组基因亚型的腰椎T值之间的差异比较无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 ERα基因rs2234693位点SNPs与腰椎BMD值和T值的关系

Note:When *P<0.05,compared to C/C.

2.3 ERα基因rs9340799、rs2234693位点SNPs与股骨BMD的关系

比较ERα基因rs9340799位点各基因型患者间股骨BMD的差异,发现该位点的3种基因型组间股骨BMD值差异不具有统计学意义(P>0.05)(表4)。

表4 ERα基因rs9340799位点SNPs与股骨BMD值和T值的关系

分析另一ERα基因rs2234693位点各基因亚型患者间股骨BMD的差异,发现该位点3种基因型组间股骨BMD值比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)(表5)。

表5 ERα基因rs2234693位点SNPs与股骨BMD值和T值的关系

3 讨论

本研究纳入的所有病例均为绝经后乳腺癌患者,其AIBL的发生主要和绝经状态以及AIs治疗相关。流行病学调查表明,绝经后女性的体内雌激素水平普遍低于绝经前女性[8],更易出现骨代谢异常。应用AIs治疗即通过抑制芳香化酶,减少体内雌激素,能够降低对乳腺癌细胞刺激并提高疗效,但也加速了骨代谢异常的发生。多项大型临床研究已证实,AIs治疗在带来获益的同时,对骨代谢异常的发生带来较高风险。ATAC[9]研究随访68个月数据显示,阿那曲唑治疗组的骨折发生率高于他莫昔芬治疗组(11%vs. 7.7%)(P<0.01)。BIG1-98[10]研究则发现来曲唑组的骨折发生率高于他莫昔芬组(8.6%vs. 5.8%)(P<0.01)。MA.17R研究结果表明[11],AI组发生骨折和新发骨质疏松的风险上升。因此,雌激素的缺乏可能是AIBL发生的重要原因。

雌激素在人体内的作用离不开相关受体的介导,因此ERα基因多态性可能直接影响与雌激素相关的生命活动。ERα基因第一内含子中存在重要的基因调节序列,其突变可能使ERα在表达与功能上产生差异[12]。曹兰青等[13]研究发现雌激素受体XbaⅠ X等位基因可能对乳腺癌患病风险具有保护效应。另有国内研究表明汉族女性PvuⅡ pp型者比壮族女性罹患乳腺癌的风险增加[14]。一项Meta分析显示ERα基因PvuⅡ位点多态性与亚洲女性膝骨关节炎遗传易感性有一定关联性[4]。对144例患者的观察发现,ERα基因XbaI位点多态性中XX等位基因对于老年女性髋部骨质疏松发病有一定的影响,且与年龄增长呈正相关[15]。由上可知,ERα第一内含子上的XbaⅠ、PvuⅡ基因多态性与骨代谢异常的发生率以及乳腺癌的患病风险存在关系,那么其与AIBL之间可能亦存在一定联系。随着研究的深入,ERα第一内含子上的2个SNPs位点已被证实与骨代谢相关。王伟等研究发现ERα基因rs2234693位点基因多态性与绝经后妇女骨质疏松症明显相关[16]。另一研究则证实rs9340799中A等位基因与中国汉族女性的膝骨关节炎存在相关[17]。以上研究证实这2个SNPs位点与普通人群中的骨代谢异常存在相关,但对于乳腺癌术后应用AI这一特殊人群骨代谢异常的基因多态性研究尚存空白。故本研究将rs9340799、rs2234693位点作为研究对象,以探索2位点SNPs与AIBL之间的关系。

本研究纳入116名绝经后乳腺癌术后应用AIs治疗的患者,行ERα基因rs9340799、rs2234693位点测序,发现2个位点的等位基因分布频率以及各基因亚型实际频数与正常人群女性中分布频率和基因亚型的理论频数一致,并与近年国内已有相关报道和本课题组前期研究结果类似[7,18],证明所选样本具有代表性。通过比较各基因型患者腰椎骨密度发现,对于rs9340799位点,A/A、A/G基因型的腰椎BMD值均高于G/G基因型患者;而rs2234693位点的T/T、C/T基因型的腰椎BMD均优于C/C基因型患者;携带纯合型A、T基因型患者的腰椎BMD值高于携带有C、G等位基因的亚型。据此笔者认为ERα基因rs9340799、rs2234693位点SNPs可能是影响应用AIs乳腺癌患者腰椎BMD值变化的因素之一,并从一定程度上预判AIBL的发生发展。但观察比较各亚型之间腰椎T值、股骨头BMD值、T值的关系,发现携带有A、T等位基因患者的腰椎T值、股骨头BMD值、T值表现虽优于纯合型C、G等位基因的患者,但差异无统计学意义。这可能与不同部位的骨质状况差异、测量方法误差、样本例数较少有关,值得进一步深入研究。

综上所述,本研究发现芳香化酶抑制剂相关骨丢失(AIBL)的发生可能与ERα基因特殊的亚型相关。ERα基因rs9340799和rs2234693位点与AIs所致的腰椎骨代谢异常存在关联,其中C、G等位基因可能是发生AIBL的易感型基因,可为绝经后乳腺癌患病群体的精准治疗提供依据:对于携带这2组等位基因的患者,应充分考虑其AIBL发生的风险与AI治疗获益之间的利弊,选择合适的内分泌治疗方案;对于已应用AI治疗的患者,则应注重其骨代谢指标及骨密度的随访监测,积极且有效的预防骨丢失的发生及进展。

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