拉曼光谱在癌症组织学诊断中的研究进展

赵倩妤 综述 孙轶华 审校

癌症是人类健康的杀手，其早期临床表现并不是十分特异，因此患者就诊时往往已处于中晚期，而早期诊断和及时有效的治疗又与患者的生存率和生存质量密切相关。为了寻求一种敏感、准确且无损的癌症早期检测工具，近年来，拉曼光谱已经成为生物化学、药学及临床医学等多个领域的研究热点。本文基于拉曼光谱在癌症组织学方面的研究做一综述。

1 拉曼光谱的原理及特点

拉曼光谱是一种强大的分析技术，既可以测量复杂生物样品的化学成分，又能够提供有关化学成分的定量信息，具有在分子水平上检测生物化学变化的潜在能力。拉曼光谱利用光的非弹性散射，能够提供细胞内部结构和构象的光谱特征，例如蛋白质、核酸和脂质，从而反应癌症早期所引起体内的物质变化[1]。因此，拉曼光谱可用于癌症的诊断，预后的判断或作为评估疗效的新型工具。

拉曼光谱具有高度的化学特异性，不需要对标本进行染色或标记即可获得丰富的分子信息。目前，癌症的诊断主要依赖于X射线、CT检查、B超、MRI检查以及肿瘤标志物检测等，而病变组织活检仍然是癌症确诊的金标准。常规的影像学检测结果虽然可以为临床的诊断提供一定的依据，但是对于微小病灶的发现仍缺乏敏感性，且花费较多，同时组织活检又给患者带来了极大的痛苦，并且存在一定的主观性。肿瘤标志物的检测虽然应用广泛，但其诊断效能并不理想，Feng等[2]采用四项肿瘤标志物(CEA、CA19-9、AFP和CA125)联合的方式对胃癌进行诊断，其阳性率仅为10.4%，而李晓舟等[3]利用激光诱导拉曼光谱技术对萎缩性胃炎患者、胃癌患者血清进行分析，其判别胃癌和萎缩性胃炎的准确率可达92%。拉曼光谱作为一种非侵入性的，富含高生化信息含量的检测手段，可以直接对生物样本(组织、血浆、唾液等)进行检验[4-6]，极大的减轻了患者的痛苦及经济负担。

2 拉曼光谱在癌症中的应用

2.1 胃癌

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一。2012年，全球约有925 000人被诊断为胃癌，占新发癌症的6.8%[7]。与其它癌症相比，早期胃癌的生存率较高且预后较好，因此，寻求一种胃癌早期诊断的新模式对于改善胃癌患者的死亡率有着重要的意义。

Luo等[8]应用近红外拉曼光谱技术对胃癌组织、癌前病变组织(腺瘤性息肉)及正常胃黏膜组织的拉曼光谱进行了研究，发现在853(脯氨酸的C-C伸缩模式)、936(蛋白α-螺旋构象中的C-C伸缩)、1032(苯丙氨酸的C-H伸缩)、1174(酪氨酸的C-H弯曲)和1208 cm-1(苯丙氨酸和色氨酸的C-C6H5拉伸模式)附近的拉曼峰的强度从正常到癌组织逐渐降低，当正常组织逐渐向腺瘤性息肉和腺癌组织转化时，位于1323，1335，1450和1655 cm-1(表征蛋白质和核酸)处的拉曼峰逐渐增强(图1)。另一方面，相对于正常组织，腺瘤性息肉和胃癌组织在1640～1675 cm-1的光谱范围内出现了明显的红移。采用PCA-NBC、留一法及交叉验证法对结果进行判别分析，灵敏度分别为96.3%，96.9%和96.9%，特异度分别为93%，100%和95.2%，可见，与多变量统计算法相结合的近红外拉曼光谱技术可以在分子水平上实现对胃癌及癌前病变的早期诊断。Zhou等[9]在高波数区(2800～3000 cm-1)和低波数区(800～1800 cm-1)分析了38例正常组织和37例胃癌组织的拉曼光谱特征，并分别对两个区域诊断的特异度和灵敏度进行了评估，初步得到以下结论：(1)胃癌组织1157 cm-1的类胡萝卜素信号、1319 cm-1和1338 cm-1的蛋白质和核酸信号强于正常组织，而在853 cm-1的胶原信号低于正常组织；胃癌组织位于2932 cm-1的蛋白信号显著低于正常组织；(2)在低波数区诊断胃癌的灵敏度和特异度高于高波数区，但是高波数区域包含不在低波数区域中显示的条带(脂质、蛋白质和水有关的信息)，因此利用高波数和低波数区域的互补性质能使得胃癌的光学诊断更加完善。

图1 正常胃黏膜、腺瘤性息肉、胃腺癌组织的平均光谱图Figure 1 Comparison of average standardized Raman spectra with distinct Raman peaks of the normal，adenomatous polyp，and adenocarcinoma gastric tissue

2.2 口腔鳞状细胞癌

口腔鳞状细胞癌约占口腔癌的90%～95%[10]，是人类十种最常见的恶性肿瘤之一，吸烟和饮酒是引起口腔鳞状细胞癌的重要危险因素。

Christian等[11]应用便携式移频激发差分拉曼光谱(SERDS)研究了12例离体口腔鳞状细胞癌组织，发现归属于脂质(1745，1440，1330 cm-1)的光谱特征在癌组织中明显减弱，而归属于蛋白质及核酸(1550 cm-1)的其他光谱特征有增强的趋势。薛丽丽等[12]应用配备光纤探头的便式拉曼光谱仪采集了新鲜的口腔黏膜鳞状细胞癌、上皮重度异常增生及正常黏膜组织的拉曼光谱，研究发现，正常黏膜组织、上皮重度异常增生以及口腔鳞状细胞癌组织间的拉曼光谱存在显著的差别：上皮重度异常增生和口腔鳞状细胞癌组织拉曼光谱中归属于核酸(746，825，893 cm-1)、蛋白质(640，664，853，1002，1445及1653 cm-1)及脂质物质(957，1306 cm-1)的谱峰明显高于正常黏膜上皮组织，结合PCA-DFA建立的分类诊断模型可以很好的表现出3类不同组织的拉曼光谱间的差异。

2.3 宫颈癌

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤。2013年，全世界有新发病例485 000名，其中死亡病例236 000名[13]。虽然近年来宫颈癌的发病率有所下降，但其年轻化的趋势愈加突显，因此，对于宫颈癌的早期筛查与及时诊断仍十分重要。

张海鹏等[14]对新鲜宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变Ⅲ级组织及正常宫颈组织的拉曼光谱进行探测，在正常的宫颈组织中，以817，1127，1176，1450，1769 cm(归属于脂类)谱带处的拉曼峰为主导，而发生病变的宫颈组织以755，1003，1372，1542，1577 cm-1(归属于蛋白质)为主。其中宫颈上皮内瘤变Ⅲ级组织的拉曼峰集中在853和1546 cm-1(归属于蛋白质)处，并且在1515 cm-1处出现了在正常组织中含量甚微的类胡萝卜素的拉曼谱带。而宫颈癌组织则含有明显的核酸特征峰(784，1094，1345 cm-1)。Amuthachelvi等[15]应用偏振拉曼光谱和常规拉曼光谱对同一位点的正常宫颈组织及宫颈癌组织进行了探测，并比较了两种光谱的灵敏度和特异度：偏振拉曼光谱除了能够提供来自常规拉曼光谱的一般化学信息之外，还能给出关于振动的取向和对称性的大量信息，常规光谱法产生的灵敏度为92.0%，特异度为75%，精确度为82.0%，而偏振拉曼光谱法测得的灵敏度、特异度和准确度均高于常规拉曼光谱法。可见，偏振拉曼光谱可以提供有利于疾病诊断的更为丰富的信息。

2.4 鼻咽癌

过去10年的流行病学趋势表明，即使在高发地区，鼻咽癌的发病率和死亡率均有下降的趋势[16]，发病率大于1/105，然而它是华南(包括香港)地区高发的恶性肿瘤，发病率大于20/105[17]，因其解剖位置较复杂，故诊断较为困难。

Qiu等[18]应用显微拉曼光谱对30例早期和46例晚期的离体鼻咽癌组织进行了测定，二者在853，937，1004，1032，1094，1209，1268，1304，1340，1450，1527和1660 cm-1处具有明显差异。相对于晚期鼻咽癌组织，位于1032和1209 cm-1的拉曼光谱强度明显高于早期鼻咽癌组织，而位于853，937，1004，1094，1268，1304，1340，1450，1527和1660 cm-1峰的强度在晚期鼻咽癌组织中显著降低。这些强度差异表明，在不同阶段的鼻咽癌组织中，有某些特定的生物分子显著增加或减少。利用PCA-LDA算法计算诊断的灵敏度为70%(21/30)，特异度为78%(36/46)，说明显微拉曼光谱联合多元统计算法具有区分早期和晚期鼻咽癌组织的潜能。Li等[19]测定了鼻咽癌组织和正常鼻咽组织的拉曼光谱，鼻咽癌组织归属于苯丙氨酸(1001 cm-1)、核酸(1207、1340 cm-1)和脂质(1658 cm-1)的拉曼信号强度较正常组织更为突出，而正常组织中的脯氨酸(848 cm-1)、缬氨酸(936 cm-1)、磷脂和胶原(1446 cm-1)的拉曼峰明显强于鼻咽癌组织(表1)。在癌症和正常对照组之间观察到特异的光谱特征和相对强度差异，反映了与恶性转化相关的分子和细胞变化。结果表明，拉曼光谱具有巨大的潜力，能够及时分析和诊断鼻咽癌，为进一步开发内镜拉曼仪器的临床应用提供了坚实的基础。

表1 鼻咽癌组织主要拉曼光谱峰的归属

2.5 乳腺癌

乳腺癌是我国女性中最常见的恶性肿瘤，但因筛查体系不健全、预防意识不足、诊疗资源不均衡等原因，导致晚期病人居多[20]，严重影响了患者的生存率。

Bing等[21]分别测定了正常乳腺组织、非典型性导管增生组织、原位导管癌组织和浸润性导管癌组织的拉曼光谱。当乳腺组织向恶性转化时，细胞内物质的成分、结构均会发生改变，具体表现如下：(1)正常乳腺组织的拉曼谱带主要归属于脂质(1265，1300，1441和1743 cm-1)，相对于正常组织，非典型性导管增生组织的蛋白质的振动模式(1267，1301和1447 cm-1)较为突出，并且在1660 cm-1谱带处出现了蓝移；(2)在恶性组织的1600～1800 cm-1区域，与其对应的脂肪链、磷脂、蛋白质和核酸的浓度随着组织恶性程度的增加而增加。Depciuch等[22]对2例三阴性乳腺癌病人的正常乳腺组织，化疗前的乳腺癌组织，化疗后的乳腺癌组织以及在癌性乳腺区域周围的非癌性乳腺组织进行了研究，发现在正常乳腺组织中，特征峰主要位于酪氨酸(849 cm-1)和苯丙氨酸(1004 cm-1)的区域，此外，源自于类胡萝卜素的C=O健的谱带(1158和1518 cm-1)也较为突出；化疗前的乳腺癌组织的拉曼峰主要归属于脯氨酸(588，1098 cm-1)，叔酰胺的CN键(1269 cm-1)以及衍生自脂肪的CH健；558 cm-1处的谱带在乳腺癌组织、化疗后的乳腺癌组织以及癌性乳腺区域周围的非癌性乳腺组织中均较为突出；在化疗后的组织中，苯丙氨酸的谱带(1004 cm-1)消失，而脂质的量显著增加(2888，2926 cm-1)。这一事实证明，拉曼光谱有利于乳腺癌的病因学研究，同时也具有成为乳腺癌化疗监测的一种有效手段。

2.6 结直肠癌

结直肠癌的发病与饮食、肥胖、缺乏身体活动、吸烟和中度到重度酒精使用均相关[23]。

罗舒文等[24]采用近红外拉曼光谱技术对离体的正常结肠组织、腺瘤性息肉和腺癌组织的拉曼光谱进行了比对分析，这三类组织的光谱强度有着显著的差异：从正常组织逐渐向腺瘤性息肉和腺癌发展的过程中，830，855，1032，1210 cm-1附近的拉曼信号强度呈递减的趋势，表明某些特定物质的含量有所减低，例如脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等。另外，在上述病变的发展过程中，位于1323，1335，1655 cm-1附近的拉曼信号强度呈递增趋势，表明某些特定物质的含量有所增加，例如蛋白质和核酸等。Li等[25]采用近红外拉曼光谱和特征选择技术检测结直肠癌，主要变化发生在800～860 cm-1，940～1030 cm-1，1210～1400 cm-1和1580～1660 cm-1的光谱范围内，其分别包含与蛋白质、核酸和脂质相关的信号。在800～860 cm-1和1580～1660 cm-1范围内正常组织的拉曼信号明显强于癌组织，而在1210～1400 cm-1范内的拉曼信号强度则相反。尤其是癌组织中归属于核酸的拉曼谱带1323 cm-1(蛋白质和核酸的CH3=CH2扭转)与正常组织相比变宽并且变强，揭示出与正常组织相比，肿瘤组织中的核酸含量明显增多。这些变化表明在与肿瘤转化相关的结直肠组织中存在一些类型的生物分子的相对变化。

3 小结与展望

拉曼光谱作为一种新型的无创检测方法，可以反映正常组织到癌变的恶性转化过程中的生化组成和结构的改变，不但可以避免组织活检给病人带来的痛苦与负担，而且可以弥补常规检测方式中存在的不足。但该项技术仍处于初步研究阶段，其用于癌症筛查和诊断的标准尚未统一，且拉曼散射强度易受到背景荧光的干扰。随着拉曼光谱技术的不断完善，以及科研人员的不断创新，拉曼光谱有望成为临床癌症早期诊断的新模式。

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