猪感染PRRSV后Cathelicidins抗菌肽基因的表达情况

卢艳敏

(衡水学院生命科学系，河北衡水 053000)

抗菌肽是动物天然免疫反应的重要组成部分，具有广谱抗菌活性，对细菌、真菌、原虫和病毒均具有较强的杀伤作用[1]，另外还可以抗癌、促进伤口愈合，因此具有较大的药用开发价值。抗菌肽是生物体经诱导产生的具有抗菌活性的小分子多肽，在机体抵抗病原入侵中起着重要作用[2]，具有分子量小、抗菌谱广、抗菌活性高、不易使病原菌产生耐药性、不破坏动物体细胞、无免疫原性等优点。抗菌肽作用机制独特，主要有膜作用机制和胞内作用机制。最新研究表明，抗菌肽还存在其他的杀菌机制，Chu等研究发现，抗菌肽α-defensin 6可以结合到鼠伤寒沙门氏菌表面，通过自我组装，在细菌周围形成一些小纤维和纳米样纤维，从而减少细菌黏附到肠道黏膜，以达到保护机体的目的[3]。汪以真发现，猪源hepcidin能够使大肠杆菌K88聚集成团，形成网状结构包裹[4]。

猪源抗菌肽主要包括防御素(defensins)和cathelicidins两大家族，目前已发现了约30种猪源抗菌肽，其中Cathelicidins有PR-39、PG1-5(protegrin)、PF1-2(prophenin)和PMAP等4类抗菌肽[1]。cathelicidins基因由4个外显子和3个内含子组成，1～3个外显子编码N-端信号肽区域(PRE)和保守的cathelin区域(PRO)，第4个外显子编码Pro区的最后几个残基和高度特异的C-端成熟肽区域。与其他抗菌肽相比，cathelicidins家族的抗菌活性更强[5-6]，抗菌作用迅速[7]，对耐药菌株也具有较强的活性[8]、低的溶血活性以及细胞毒性，在新型抗菌药物开发领域显示出巨大的潜力[9]。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是猪的一种高度传染性疾病，最早在北美洲和欧洲发现，我国于1955年首次分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。PRRSV可引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎及产弱仔等繁殖障碍，并可引起各年龄阶段猪的呼吸道症状，仔猪死亡率高，同时还会导致免疫抑制和持续性感染等症状。PRRSV对我国乃至世界养猪业造成了巨大的经济损失，已成为严重威胁养猪业发展的重要传染病之一，而现有疫苗及药物效果均不理想[10]。本试验主要研究猪感染PRRSV后体内cathelicidins抗菌肽的表达情况，为PRRSV新药物的开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 PRRSV由国家野生动物疫病研究中心保存，PRRSV感染1月龄无特定病原体(SPF)猪(24头)，分别于感染后12、24、72、168 h取样(以未感染病毒的1月龄SPF猪6头作为对照)，取肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肝脏、骨髓等组织，将样品置于冻存管中，液氮速冻，-80 ℃保存。

1.1.2 试剂 超纯RNA提取试剂盒(Ultrapure RNA Kit)，购自北京康为世纪生物科技有限公司；SupermoⅢM-MLV反转录酶，购自北京百泰克生物技术有限公司；dNTP Mixture、Ribonuclease Inhibitor和Oligo(dT)18Primers，购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；TransStart Green qPCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 采用超纯RNA提取试剂盒(Ultrapure RNA Kit)取冻存组织进行总RNA提取，操作过程按照试剂盒说明书进行。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，紫外分光光度计下测定RNA浓度，随后进行反转录，合成cDNA第一链。以合成的cDNA作为Real-Time PCR(即实时定量PCR)分析的模板，-20 ℃保存备用。

1.2.2 Real-Time PCR Real-Time PCR(实时定量PCR)引物(由上海英骏生物技术有限公司合成)序列[1，11]见表1，按照北京全式金生物技术有限公司TransStart Green qPCR SuperMix说明书进行Real-Time PCR，反应体系：P10.5 μL，P20.5 μL，2×TransStartTMGreen qPCR SuperMix 12.5 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，模板1.0 μL，ddH2O 10.0 μL。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环。相对定量分析参照2-ΔΔCT法[12]。实时定量PCR分析共进行3次生物学重复。

表1 Cathelicidin引物序列

2 结果与分析

2.1 PR39的表达情况

猪感染PRRSV之后，在脾脏、肺、肺门淋巴结中均检测到PR39的表达，且随着感染时间的增长，表达量也有所变化。如图1所示，猪感染PRRSV后，PR39在脾脏中的表达量在 0.5、1、3和7 d的4个感染时间段中，感染1 d后表达量最高，其次为感染0.5 d；猪感染PRRSV后，PR39在肺中的表达量在0.5、1、3和7 d的4个感染时间段中，感染1 d后表达量最高，其次为感染3 d；猪感染PRRSV后，PR39在肺门淋巴结中的表达量在0.5、1、3和7 d 4个感染时间段中，在感染1 d后表达量最高，然后依次是感染0.5、3、7 d，但感染0.5 d和 3 d 后的表达量差异不大。

综上所述，猪感染PRRSV后，PR39在肺、肺门淋巴结和脾脏3种组织中的表达量均呈现先升高后降低的趋势，且都是在感染1 d后表达量达到最高值。

2.2 Progerin 1的表达情况

猪感染PRRSV之后，在脾脏、肺、肺门淋巴结中均检测到Progerin1(PG1)的表达，感染时间不同，其表达量有所变化，但差异较小。如图2所示，猪感染PRRSV后，Progerin1在脾脏中的表达量在0.5、1、3和7 d 4个感染时间段中，在感染 1 d 后表达量最高，其次为感染0.5、7、3 d；猪感染PRRSV后，Progerin1在肺中的表达量在0.5、1、3和7 d 4个感染时间段中，在感染1 d后表达量最高，其次为感染3、7、0.5 d；猪感染PRRSV后，Progerin1在肺门淋巴结中的表达量在0.5、1、3和7 d 4个感染时间段中，在感染1 d后表达量最高，然后依次是感染0.5、3、7 d。综上所述，猪感染PRRSV后，Progerin1在脾脏、肺和肺门淋巴结3种组织中的表达量均呈现先升高后降低的趋势，且都是在感染1 d后表达量达到最高值，Progerin1的表达量在3种组织中的变化均不明显。

2.3 progerin 1-5的表达情况

猪感染PRRSV后，在脾脏、肺、肺门淋巴结中均检测到Progerin1-5(PG1-5)的表达，在脾脏中表达量较高，而在肺与肺门淋巴结中表达量较少，随着感染时间的增长，表达量也有所变化。如图3所示，猪感染PRRSV后，progerin1-5在脾脏中的表达量在0.5、1、3和7 d 4个感染时间段中，在感染 1 d 后表达量最高，然后依次为0.5、7、3 d；猪感染PRRSV后，progerin1-5在肺中的表达量在0.5、1、3和7 d 4个感染时间段中，在感染1 d后表达量最高；猪感染PRRSV后，progerin1-5在肺门淋巴结中的表达量在0.5、1、3和7 d 4个感染时间段中，在感染1 d后表达量最高，然后依次是感染0.5、3、7 d，但感染3 d与7 d后的表达量差异不大。

综上所述，猪感染PRRSV后，progerin1-5在脾脏、肺和肺门淋巴结3种组织中的表达量均呈现先升高后降低的趋势，且都是在感染1 d后表达量达到最高值，其中在脾脏中的表达量变化较大，而在肺中的表达量变化不明显。

2.4 PMAP23的表达情况

猪感染PRRSV之后，在脾脏中未检测到PMPA23的表达，肺、肺门淋巴结中检测到PMPA23的表达，且随着感染时间的增长，肺、肺门淋巴结中PMAP23的表达量有所变化。如图4所示，猪感染PRRSV后，PMAP23在肺、肺门淋巴结中的表达量在0.5、1、3和7 d 4个感染时间段中，在感染1 d后表达量最高，然后依次为感染0.5、3、7 d。

综上所述，猪感染PRRSV后，PMAP23在肺、肺门淋巴结中的表达量均呈现先升高后降低的趋势，且都是在感染1 d后表达量达到最高值。

3 讨论

抗菌肽分子量小，大部分具有12～50个氨基酸，具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌性等特点，在农业、医药等领域受到广泛的重视，全球科研人员对抗菌肽的作用机制、药物疗效、安全性等进行了深入的研究，并且建立了抗菌肽数据库(APD：http：//aps.unmc.edu/AP/main.php)[13]。目前，该数据库已收录2 700多种抗菌肽，其中272种抗菌肽来源于细菌，4种抗菌肽来源于古细菌，8种抗菌肽来源于原生生物、13种抗菌肽来源于真菌，335种抗菌肽来源于植物，2 043种抗菌肽来源于动物。这些抗菌肽具有抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、抗癌、抗原虫等活性。

研究发现，多种抗菌肽具有抗病毒活性，如抗艾滋病病毒、疱疹病毒。LL-37是人体内唯一的cathelicidins，通过直接的灭活试验发现，LL-37可以显著降低几种病毒对人的感染[14-17]。动物抗菌肽通过与病毒糖蛋白或细胞表面的病毒受体的相互作用，可以直接抑制病毒的感染，也可以通过激活其他抗病毒反应来间接地抑制病毒感染[18]。

本试验测定了PRRSV在感染猪后的不同时间段内，脾脏、肺、肺门淋巴结中cathelicidins表达量的变化情况。研究结果表明，PR39、PG1、PG1-5、PMAP23的表达受到PRRSV的影响，猪感染PRRSV后，脾脏、肺、肺门淋巴结中的PR39、PG1、PG1-5、PMAP23表达量上调，其中PRRSV对PR39与PG1-5表达量的影响较大。下一步工作合成PR39、PG1、PG1-5、PMAP23多肽，测定抗菌肽对PRRSV的灭活效果以及对细胞的毒性，为PRRSV新药物的开发提供新的思路。

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