芸薹属蔬菜遗传改良与种质创新研究进展

支 肖 曹丽雯 于宁宁 齐振宇 陈利萍

（浙江大学农业与生物技术学院，浙江杭州 310058）

芸薹属（Brassica）植物包括白菜类、芥菜类以及甘蓝类蔬菜，具有种类繁多、遗传资源丰富、产量高、抗性强、栽培面积广、生长周期短等特点（Struss et al.，1991；Mei et al.，2011；Geng et al.，2013）。由于长期的人工选择和优良品种的大面积栽培，以及人们对蔬菜种类和品质要求的不断提高，现有的和可利用的亲本资源已具有一定的局限性。利用现代生物技术手段创制出优质、抗病、高产的新种质资源，是当前蔬菜产业亟待解决的重要问题之一。本文从远缘杂交、种间嫁接、体细胞杂交、分子育种等方面综述了芸薹属蔬菜在遗传改良及种质创新研究上的新进展，以期为芸薹属蔬菜新品种的选育提供理论依据和新途径。

1 远缘杂交

远缘杂交（distant hybridization）是指亲缘关系较远的种属间或物种间的杂交，它可以使优良性状的基因在种、属之间通过有性杂交的方式进行转移。自1917年Kajanus将甘蓝型油菜与芜菁通过有性杂交的方法获得了种间杂种以来，远缘杂交被广泛应用到芸薹属蔬菜育种中（Kajanus，1917）（表1）。例如，Sharma等（2017）将花椰菜Pusa Sharad（B. oleracea，CC）与抗黑腐病的埃塞俄比亚芥NPC-9（B. carinata，BBCC）杂交加倍，获得的F1（BCC）具有黑腐病抗性，继而通过将F1与花椰菜回交使黑腐病抗性渐渗入回交第1代植株，实现了埃塞俄比亚芥的抗黑腐病优良基因向花椰菜的转移。再如，十字花科植物中的多种类型的雄性不育源，Ogura细胞质雄性不育（CMS）、Polima CMS等通过甘蓝型油菜被转移到大白菜或芜菁中（柯桂兰 等，1992；姚祥坦 等，2004），其中甘蓝型油菜中的Ogura CMS是通过萝卜转育而来。远缘杂交后全套异源染色体组导致的遗传学上的不稳定性是远缘杂种生产应用的最大问题。为了解决远缘杂种的不稳定性，育种家们在远缘杂交的基础上创建了异附加系（alien addition line）。异附加系是指通过杂交或其他方法在原有染色体组中附加1条或者1条以上异源种属的染色体。异附加系不但实现了外源优异基因的转移，还避免了其他异源染色体上不良基因的影响。例如，刘炜等（2008）通过远缘杂交获得大白菜—甘蓝异源三倍体（AAC）后，与二倍体大白菜（B. rapa，AA）回交，从中分别筛选出大白菜—甘蓝7号和9号单体附加系，为进一步获得大白菜和结球甘蓝易位系、代换系提供了基础材料。

表1 远缘杂交在芸薹属蔬菜种质创新中的应用

在远缘杂交过程中，异源基因组的相互作用导致大量遗传与表观遗传变异，使杂种后代在生物量、适应性等方面表现出超亲性状，形成杂种优势。Ghani等（2014a，2014b）通过大白菜与黑芥的远缘杂交及其染色体加倍，观察到异源四倍体杂种后代AABB与双亲（AA和BB）相比，表现出明显的生长优势。通过small RNA高通量测序，发现与亲本相比，AABB的miRNAs总体表达水平呈现上升趋势，miRNA表达水平的改变引起了表型相关基因的改变，该研究结果证明了small RNA水平的改变与远缘杂交中基因表达水平改变及超亲性状的产生具有相关性。这一研究结果为蔬菜遗传改良与新品种选育提供新的理论依据。

Li等（2015）以茎瘤芥（B. juncea，AABB）和紫甘蓝（B. oleracea，CC）为亲本，通过远缘杂交和人工加倍获得芸薹属异源六倍体蔬菜（AABBCC）。该六倍体能作为桥梁作物，合成不同种类的异附加系、渐渗系等，满足不同育种需求。饶琳莉（2015）将茎瘤芥和紫甘蓝杂交得到的异源六倍体（AABBCC）分别与茎瘤芥和大白菜进行杂交，成功得到基因组为AABBC与AABC的芸薹属新种质，新种质表现出独特的植物学性状，有望通过AABBC再与亲本茎瘤芥AABB回交选育出茎瘤芥异附加系。

2 种间嫁接

嫁接（grafting）是植物的一种无性繁殖方式，它是将植物体的器官、组织接到另一植物的适当部位，使两者接口愈合，长成为一个新植株的技术（李继华，1990）。由于嫁接具有快速更新品种、增强植物环境适应性、提高作物产量和品质等优点，已被广泛运用于农业生产中，特别是在果树、观赏树木、茄科蔬菜及瓜类作物的繁殖和育种上发挥了巨大作用。然而，由于芸薹属蔬菜的生产方式有别于茄科作物及瓜类作物，嫁接技术一般不被应用于芸薹属蔬菜生产。

近年来，芸薹属蔬菜嫁接试验的开展主要是为春化机理等理论问题的解析提供试验体系。例如，陶鹏等（2017）将需要绿体春化的结球甘蓝嫁接于常年抽薹的薹菜（菜心）砧木上，即使在不经过绿体春化的情况下，结球甘蓝也能抽薹开花，该现象表明春化相关的信号物质可能通过嫁接砧木、接穗之间的互作得到了交流，并且改变了接穗的开花习性。

物种之间的嫁接是否会改变嫁接当代及其后代的遗传信息，一直是国际上的研究热点。由于嫁接的本质是异源细胞的相互交流，因此Hirata等（1990）开创性地提出了通过茎尖嫁接人工创建种间细胞的交流体系，即种间嵌合体。迄今为止，已经获得了萝卜与紫甘蓝嫁接嵌合体（Hirata et al.，2000）、茎瘤芥与紫甘蓝嫁接嵌合体（Chen et al.，2006）等。近年来的研究表明，茎瘤芥与紫甘蓝嵌合体自交后代表现出叶形、顶端分生组织等方面可遗传的变异，成为新的茎瘤芥种质资源（Li et al.，2013；Cao et al.，2016）。因此，芸薹属蔬菜物种之间的茎尖嫁接为种质资源的创制提供了一条崭新的途径。

3 体细胞杂交

植物体细胞杂交（somatic hybridization）又称原生质体融合（protoplast fusion），是指双亲的原生质体在特定的物理或化学因素作用下诱导融合成杂种细胞，通过细胞分裂并分化和再生出植株。由于芸薹属蔬菜较易进行原生质体操作，因而体细胞杂交被广泛运用在芸薹属蔬菜的种质创新中（表2）。体细胞杂交能有效克服有性杂交不亲和性，跨越生殖隔离，创造异源多倍体新种质，实现遗传物质在种、属间的无性转移。例如，Lian等（2011a，2011b）分别以叶用芥菜和青花菜、青花菜和大白菜为供受体亲本，采用40%聚乙二醇融合法进行原生质体融合，获得具有双亲基因组的异源四倍体再生植株。

表2 体细胞杂交在芸薹属蔬菜种质创新中的应用

然而，细胞对称融合在导入有用基因的同时，也带入了供体亲本的全部不利基因，且两套基因组的融合常常导致杂种后代败育。近年来，不对称细胞融合技术的发现和利用为解决细胞对称融合过程中不利基因的导入及后代的败育等问题提供了一条有效途径。例如：通过非对称体细胞杂交技术，黑芥的抗黑腐病基因、Ogura CMS等细胞质雄性不育源先后被转育到花椰菜等甘蓝类蔬菜及芸薹属其他蔬菜中，实现了优良性状在细胞之间的快速转移（Sigareva & Earle，1997；张丽 等，2008；Wang et al.，2011，2016）。

4 分子育种

分子育种主要分为基因工程育种和分子标记辅助育种。基因工程育种是以植物组织、细胞或原生质体为受体系统，导入目的基因，改良农作物遗传性状的一种育种方法。近年来，随着基因工程的发展，芸薹属蔬菜中越来越多的优异性状基因被克隆。例如：茎瘤芥膨大相关基因BjuB.RBR.b、BjuA.RBR.b、BjAPY2、orf451（Shi et al.，2014；罗天宽 等，2015；Cao et al.，2015），普通白菜花粉发育相关基因BcMF23a、BcMF23b（Lin et al.，2016）等。但是，由于传统转基因存在安全隐患，转基因芸薹属蔬菜的生产应用一直备受争议。最近，基因定点编辑整合技术CRISPR/Cas9系统被逐步运用到芸薹属蔬菜的遗传改良中。例如，Lawrenson等（2015）利用CRISPR/Cas9系统将甘蓝DH1012中编码赤霉素合成基因BolC.GA4的定点敲除，实现了植株的矮化。该项技术将逐步消除转基因技术的安全隐患，有望运用在芸薹属蔬菜种质创新上的生产实践中。

分子标记辅助育种是指利用分子标记与目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的。目前为止，分子标记在芸薹属蔬菜种质创新中得到了较为广泛的应用，特别是抗病抗逆、品质、发育、育性等重要农艺性状的分子育种方面。由于大多数农艺性状均属于数量性状，借助QTL连锁的分子标记能够大大提高对数量性状的遗传操纵能力，从而提高育种工作中对数量性状优良基因型的选择准确性。张郎郎等（2014）利用AFLP标记构建了茎瘤芥茎膨大的连锁图谱，采用复合区间作图法定位到控制瘤状茎质量性状和横径性状各2个，共解释分别为43.28%和53.27%的表型变异。Li等（2016）以茎瘤芥和叶用芥菜为亲本构建了F2作图群体，利用EST-SSR分子标记构建了包含17个连锁群的芥菜遗传图谱，基于SSR图谱检测到4个控制茎质量的QTL位点，为控制茎瘤芥瘤状茎膨大性状相关基因的精确定位打下基础。张晓伟等（2009）通过构建大白菜DH群体，对TuMV-C4株系的苗期抗性进行QTL定位，检测到了3个QTL位点。由于分子育种能定向选育新品种，且克服了常规育种周期长、种属间隔离等缺点，已经成为芸薹属蔬菜种质创新的重要辅助手段。

5 展望

迄今为止，国内外利用远缘杂交、种间嫁接、体细胞杂交、分子育种等手段进行的芸薹属蔬菜遗传改良与种质创新已经取得了一系列的重要进展，培育了大量具有抗虫、抗病、抗逆、高产等优异性状的芸薹属蔬菜新种质。但是目前这些育种手段及获得的新种质的利用仍然存在一定的局限性。远缘杂交的主要问题表现为杂种后代存在定向选择目标性状困难，优良性状稳定耗时长，需要多代自交与回交等。因此，未来远缘杂交要与分子育种相结合，通过小孢子培养，利用分子标记辅助选择在早期确定目的基因或者染色体，这也是远缘杂交技术将来的主要发展方向。通过种间嫁接嵌合体合成虽然可以获得可遗传的变异，但是嵌合体作为一种特殊形式的嫁接，其合成具有一定的难度；而且，到目前为止嫁接引起遗传变异的分子机制尚未清楚，因此种间嫁接在芸薹属蔬菜遗传改良中存在一定的局限性。体细胞杂交是建立在原生质体培养再生植株的基础上进行的，高效再生体系的缺乏使这项技术在芸薹属蔬菜种质改良的应用中受到了一定的阻碍。分子育种是近年来发展最快的领域之一，但到目前为止在芸薹属丰富的遗传资源中挖掘到的优良基因还有限，且分子标记辅助育种还处于初级定位阶段，很少能做到精细定位。

相信随着遗传学、分子生物学等学科的迅速发展，育种技术与育种手段将会不断得到完善；同时，也应该充分发挥各育种手段的优势，实施多种育种技术相结合的策略，为芸薹属蔬菜种质创新提供更多的亲本资源，实现芸薹属蔬菜育种的重大突破。

侯喜林，曹寿椿，佘建明，陆维忠．2001．原生质体非对称电融合获得不结球白菜胞质杂种．园艺学报，28（6）：532-537．

金海霞，冯辉，徐书法．2006．通过大白菜胞质不育系与芥菜远缘杂交选育新的芥菜胞质不育系．园艺学报，33（4）：737-740．

柯桂兰，赵稚雅，宋胭脂，张鲁刚，赵利民．1992．大白菜异源胞质雄性不育系CMS3411-7的选育及应用．园艺学报，19（4）：333-340．

李继华．1990．嫁接原理与应用．北京：科学技术出版社：47-62．

刘炜，申书兴，王彦华，张成合，轩淑欣，陈雪平，李晓峰，罗双霞．2008．大白菜—甘蓝异附加系的获得与鉴定．园艺学报，35（2）：207-212．

罗天宽，刘斌，吴海涛，徐谦，裘波音，邹晓霞，李俊星，陈利萍．2015．榨菜瘤状茎膨大相关基因orf451的克隆及其表达分析．农业生物技术学报，23（1）：32-40．

饶琳莉．2015．榨菜与紫甘蓝种间异源六倍体的植物与分子特性初探〔硕士论文〕．杭州：浙江大学．

陶鹏，李必元，岳智臣，王五宏，雷娟利，赵彦婷，钟新民．2017．结球甘蓝与菜心正反嫁接比较实验．浙江农业科学，58（4）：595-596．

姚祥坦，叶纨芝，崔辉梅，张明龙，曹家树．2004．芜菁Ogura胞质不育系的选育初报．园艺学报，31（2）：220．

姚星伟，刘凡，云兴福，Ryschka U，Schumann G．2005．非对称体细胞融合获得花椰菜与Brassica spinescens的种间杂种．园艺学报，32（6）：1039-1044．

张德双，徐家炳，曹鸣庆，张凤兰．2002．大白菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的研究．华北农学报，17（1）：60-63．

张郎郎，刘斌，李俊星，陈利萍．2014．榨菜瘤状茎膨大性状遗传分析．核农学报，28（1）：22-28．

张丽，赵泓，陈斌，刘凡．2008．花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定．植物学通报，25（2）：176-184．

张晓伟，原玉香，王晓武，孙日飞，武剑，谢从华，蒋武生，姚秋菊．2009．大白菜DH群体TuMV抗性的QTL定位与分析．园艺学报，36（5）：731-736．

Atri C，Kumar B，Kumar H，Kumar S，Sharma S，Banga S S．2012．Development and characterization ofBrassica juncea-fruticulosaintrogression lines exhibiting resistance to mustard aphid（Lipaphis erysimiKalt）．BMC Genetics，13：104-112．

Cao L W，Liu B，Li J X，Yu N N，Zou X X，Chen L P．2015．Light- and temperature-regulatedBjAPY2may have a role in stem expansion ofBrassica juncea．Functional & Integrative Genomics，15（6）：753-762．

Cao L W，Yu N N，Li J X，Qi Z Y，Wang D，Chen L P．2016．Heritability and reversibility of DNA methylation induced byin vitrografting betweenBrassica junceaandB.oleracea．Scientific Reports，6：27233-27245．

Cardi T，Earle E D．1997．Production of new CMSBrassica oleraceaby transfer of‘Anand’cytoplasm fromB.rapathrough protoplast fusion．Theoretical and Applied Genetics，94：204-212．

Chen L P，Ge Y M，Zhu X Y．2006．Artificial synthesis of interspecific chimeras between tuber mustard（Brassica juncea）and cabbage（Brassica oleracea）and cytological analysis．Plant Cell Reports，25（9）：907-913．

Geng X X，Chen S，Astarini I A，Yan G J，Tian E，Meng J，Li Z Y，Ge X H，Nelson M N，Mason A S，Pradhan A，Zhou W J，Cowling W A．2013．Doubled haploids of novel trigenomicBrassicaderived from various interspecific crosses．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，113（3）：501-511．

Ghani M A，Sun Q，Li J X，Cao L W，Rao L L，Zou X X，Chen L P．2014a．Phenotypic and genetic variation occurred during wide hybridization and allopolyploidisation betweenBrassica rapaandBrassica nigra．Scientia Horticulturae，176：22-31．

Ghani M A，Li J X，Rao L L，Raza M A，Cao L W，Yu N N，Zou X X，Chen L P．2014b．The role of small RNAs in wide hybridisation and allopolyploidisation betweenBrassica rapaandBrassica nigra．BMC Plant Biology，14：272-280．

Gu A X，Shen S X，Wang Y H，Zhao J J，Xuan S X，Chen X P，Li X F，Luo S X，Zhao Y J．2015．Generation and characterization ofBrassica rapassp.pekinensis—B.oleraceavar.capitatemonosomic and disomic alien addition lines．Journal of Genetics，94（3）：435-444．

Hagimori M，Nagaoka M，Kato N，Yoshikawa H．1992．Production and characterization of somatic hybrids between the Japanese radish and cauliflower．Theoretical and Applied Genetics，84（7）：819-824．

Hansen L N，Earle E D．1995．Transfer of resistance toXanthomonas campestrispv.campestrisintoBrassica oleraceaL. by protoplast fusion．Theoretical and Applied Genetics，91：1293-1300．

Hirata Y，Yagishita N，Sugimoto M，Yamamoto K．1990．Intervarietal chimera formation in cabbage（Brassica oleraceaL．）．Japanese Journal Breeding，40：419-428．

Hirata Y，Motegi T，Xiao Q B，Noguchi T．2000．Artificiallysynthesized intergeneric chimera betweenBrassica oleraceaandRaphanus sativusbyin vitrografting．Plant Biotechnology，17（3）：195-201．

Kajanus B．1917．Über Bastardierungen zwischenBrassica napusL．undBrassica rapaL．Zeitschrift f ü r Pflanzenz ü chtung，5：265-322．

Lawrenson T，Shorinola O，Stacey N，Li C，Ostergaard L，Patron N，Uauy C，Harwood W．2015．Induction of targeted，heritable mutations in barley andBrassica oleraceausing RNA-guided Cas9 nuclease．Genome Biology，16：258-270．

Li J X，Wang Y，Zhang L L，Liu B，Cao L W，Qi Z Y，Chen L P．2013．Heritable variation and small RNAs in the progeny of chimeras ofBrassica junceaandBrassica oleracea．Journal of Experimental Botany，64（16）：4851-4862．

Li J X，Rao L L，Meng Q F，Ghani M A，Chen L P．2015．Production ofBrassicatri-genomic vegetable germplasm by hybridization between tuber mustard（Brassica juncea）and red cabbage（B．olerace）．Euphytica，204（2）：323-333．

Li J X，Zou X X，Zhang L L，Cao L W，Chen L P．2016．Linkage map construction using SSR markers and QTL analyses of stem expansion traits inBrassica juncea．Scientia Horticulturae，209：67-72．

Lian Y J，Lin G Z，Zhao X M．2011a．Morphological，cytological，and molecular characterization of hybrids and their progenies derived from the somatic hybridization ofBrassica campestrisandBrassicaoleracea．Chinese Journal of Biotechnology，27（11）：1586-1597．

Lian Y J，Lin G Z，Zhao X M，Lin H T．2011b．Production and genetic characterization of somatic hybrids between leaf mustard（Brassica juncea）and broccoli（B.oleacea）．In Vitro Cellular& Developmental Biology，47（2）：289-296．

Lin S，Huang Li，Yu X L，Xiong X P，Yue X Y，Liu T T，Liang Y，Lv M L，Cao J S．2016．Characterization ofBcMF23aandBcMF23b，two putative pectin methylesterase genes related to pollen development inBrassica campestrisssp.chinensis．Molecular Biology Reports，44（1）：139-148．

Malik M，Vyas P，Rangaswamy N S，Shivanna K R．1999．Development of two new cytoplasmic male-sterile lines inBrassica junceathrough wide hybridization．Plant Breeding，118（1）：75-78．

Mei J，Qian L，Disi J O，Yang X，Li Q，Li J，Frauen M，Cai D，Qian W．2011．Identification of resistant sources againstSclerotinia sclerotioruminBrassica specieswith emphasis onB.oleracea．Euphytica，177（3）：393-399．

Piotr K，Malgorzata P，Michal S，Elzbieta S K．2015．Interspecific hybridization of cytoplasmic male-sterile rapeseed withOguracytoplasm andBrassica rapavar.pekinensisas a method to obtain male-sterile Chinese cabbage inbred lines．Euphytica，208：519-534．

Sharma B B，Kalia P，Singh D，Sharma T R．2017．Introgression of black rot resistance fromBrassica cartinatato Cauliflower（Brassica oleracea botrytisGroup）through embryo rescue．Frontiers in Plant Science，8：1-16．

Shi H，Zou X X，Xu C，Li J X，Liu B，Chen L P．2014．The inheritance and expression patterns of two classes of retinoblastomarelated genes in the stem ofBrassica junceafrom both parental genomes．Scientia Horticulturae，176：238-247．

Sigareva M A，Earle E D．1997．Direct transfer of a cold-tolerantOguramale-sterile cytoplasm into cabbage（Brassica oleraceassp.capitata）via protoplast fusion．Theoretical and Applied Genetics，94（2）：213-220．

Struss D，Bellin U，Robbelen G．1991．Development of B-genome chromosome addition lines ofB.napususing different interspecificBrassicahybrids．Plant Breeding，106（3）：209-214．

Tonguc M，Griffiths P D．2004．Transfer of powdery mildew resistance fromBrassica carinatatoBrassica oleraceathrough embryo rescue．Plant Breeding，123：587-589．

Wan Z J，Tan Y B，Shi M H，Xu Y J，Aryamanesh N，Yan G J．2013．Interspecific introgression of male sterility from tetraploid oilseedBrassica napusto diploid vegetableB.rapathrough hybridisation and backcrossing．Crop and Pasture Science，64（7）：652-659．

Wang G X，Tang Y，Yan H，Sheng X G，Hao W W，Zhang L，Lu K，Liu F．2011．Production and characterization of interspecific somatic hybrids betweenBrassica oleraceavar.botrytisandB.nigraand their progenies for the selection of advanced pre-breeding materials．Plant Cell Reports，30：1811-1821．

Wang G X，Lv J，Zhang J，Han S，Zong M，Guo N，Zeng X Y，Zhang Y Y，Wang Y P，Liu F．2016．Genetic and epigenetic alterations ofBrassica nigraintrogression lines from somatic hybridization：a resource for cauliflower improvement．Frontiers in Plant Science，7：1258-1269．

Yarrow S A，Burnett L A，Wildeman R P，Kemble R J．1990．The transfer of‘Polima’cytoplasmic male sterility from oilseed rape（Brassica napus）to broccoli（B.oleracea）by protoplast fusion．Plant Cell Reports，9：185-188．