淳安花猪5个功能基因的多态性研究

， ，，刘平，，，*

(1.杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310024； 2.淳安县畜牧兽医局)

淳安县地处浙西，峰峦起伏，涧溪纵横，淳安花猪原产于浙江省淳安县境内的山区，在长期的民间选育过程中，逐渐形成了这一具有地方特色的优良猪种，其肉美味鲜，同时有性情温顺、产仔数多、耐粗饲等特性，是我国地方猪种“基因库”中的宝贵猪种资源。

据调查，近三十年来，淳安花猪在当地的饲养规模锐减，岌岌可危[1-4]。畜禽地方品种资源危机是当代全球性生物危机的重要组成部分。畜禽地方品种资源一旦遭到破坏，也就意味着历经亿万年进化和积累的许多优良基因的永远丢失。虽然我们还无法充分预测未来如何利用这些地方品种资源，但是拥有丰富的品种资源，人类就能够经受更大的挑战，获得更大的生存空间。畜禽地方品种资源是维持人类生存、维护生态安全和实现经济与社会可持续发展的战略性资源。因此，对淳安花猪遗传特性展开深入研究具有重要的现实意义。本试验通过研究ESR等5个功能基因在淳安花猪群体中的多态性，探讨其繁殖、生长、肉质等方面的遗传潜力，为进一步发掘其优良种质特性、开展保护利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1样品采集 淳安花猪耳组织样品23份(公5、母18)于浙江省淳安县主产区采集，将样品置于装有75%乙醇的离心管中，常温带回实验室，-20℃保存备用。

1.2基因组DNA提取 猪耳组织总DNA的提取参照《分子克隆实验指南》，应用常规的酚/氯仿法抽提。

1.3PCR引物设计与合成 参照GenBank所提供的基因序列设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表1。

表1 各基因引物信息

蛋白酶K、Tris饱和酚、琼脂糖购自华美生物工程公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶等购自上海生工生物工程技术服务有限公司(Sangon)。

1.4PCR反应体系与程序 PCR扩增反应体系组成：DNA模板100 ng，10×buffer 2.5 μL，25 mM镁离子2 μL，10 mM dNTP 0.5 μL，混合引物(上游引物和下游引物各为10 pmol/μL)0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，加水至25 μL。

PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s；54.6℃-64.8℃退火45 s；72℃延伸1 min；进行33-35个循环；最后72℃延伸10 min。

1.5PCR产物的酶切与判型 除FSHβ基因扩增产物直接电泳检测外，ESR、GH、MC4R、RYR1基因扩增产物分别用PvuⅡ、MSPI、TagI、Hha限制性内切酶进行酶切，酶切反应体系分别为：PCR产物(10 μL、8 μL、15 μL、10 μL、10 μL)，内切酶(2 U、5 U、10 U、10 U、8 U)，加10×Buffer(含BSA)、ddH2O至20 μL，37℃恒温水浴锅中消化2.5-5 h；用3.5%的琼脂糖凝胶电泳，采用DNA Ladder Markers作为分子量的标准对照，观察酶切结果，凝胶成像系统拍照，由带型判断基因型。

1.6数据统计与分析

1.6.1基因频率和基因型频率的计算

基因型频率=基因型个数/测定群体总数；

基因频率：

p是等位基因A的基因频率，q是等位基因B的基因频率，nAA、nAB和nBB分别是群体中基因型AA、AB和BB型的个体数。

1.6.2哈迪-温伯格平衡检验 哈迪-温伯格平衡检验公式如下：

Ei为理论值，Oi为实际观察值，n为等位基因数。

2 结果与分析

2.1ESR基因 PCR-RFLP电泳结果如图1所示。用PvuⅡ酶切后产生120 bp片段为AA型，65/55 bp片段为BB型，同时出现120/65/55 bp片段为AB型。

淳安花猪ESR基因型和基因频率结果见表2，淳安花猪只出现2个基因型。其中BB基因型频率为0.64，AB基因型为0.36。A、B等位基因频率分别为0.18和0.82。对该基因的遗传分布进行哈迪-温伯格平衡的x2适合性检验，可知ESR基因在淳安花猪群体中的分布符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05)。

图1 ESR基因PCR-PvuⅡ-RFLP酶切结果

2.2FSHβ基因 由于存在基因插入，因此PCR就可以直接检测FSHβ基因的多态性，详见图2。只出现500 bp条带的为AA型，只出现200 bp条带的为BB型，同时出现500/200 bp条带的为AB型。

淳安花猪FSHβ基因分型检测结果见表2。淳安花猪FSHβ基因存在3个基因型，其中AB基因型频率最高为0.68，AA基因型次之为0.18，BB基因型最低为0.14。A、B等位基因频率分别为0.52和0.48。各基因型在淳安花猪群体中的分布符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05)。

图2 FSHβ基因PCR酶切结果

2.3GH基因 PCR-RFLP电泳结果如图3所示。用MSPI酶切后产生284/222 bp片段为AA型，222/147/136 bp片段为BB型，同时出现284/222/147/136 bp片段为AB型。

淳安花猪GH基因型和基因频率结果见表2。淳安花猪只出现2个基因型，其中BB基因型频率为0.94，AB基因型为0.06。A、B等位基因频率分别为0.03和0.97。各基因型在淳安花猪群体中的分布符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05)。

图3 GH基因PCR-MSPI-RFLP酶切结果

2.4MC4R基因 PCR-RFLP电泳结果如图4所示。用TagI酶切后产生156/70 bp片段为AA型，226 bp片段为BB型，同时出现226/156/70 bp片段为AB型。

淳安花猪MC4R基因型和基因频率结果见表2。淳安花猪MC4R基因只有一种基因型AA型。

图4 MC4R基因PCR-TagI-RFLP酶切结果

2.5RYR1基因 PCR-RFLP电泳结果如图5所示。用Hha酶切后产生186 bp片段为AA型，126/60 bp片段为BB型，同时出现186/126/60 bp片段为AB型。

淳安花猪RYR1基因型和基因频率结果见表2。淳安花猪RYR1基因只有一种基因型BB型。

图5 RYR1基因PCR-Hha-RFLP酶切结果

基因样本数基因型AAABBB基因频率ABχ2值P值ESR220.000.36(8)0.64(14)0.180.822.660.10FSHβ220.18(4)0.68(15)0.14(3)0.520.482.950.09GH160.000.06(1)0.94(15)0.030.970.020.90MC4R231.00(23)0.000.001.000.00--RYR1190.000.001.00(19)0.001.00--

3 小结与讨论

3.1淳安花猪繁殖性能主效基因 猪的繁殖性状是一个重要的经济性状，繁殖性能的高低将直接影响到猪场生产效率和经济效益[5]。

一般认为，一个基因的效应(两种纯合基因型的基因型值之差)达到0.5～1.0表型标准差时，可将其看作主效基因。ESR基因对胚胎的生长发育具有重要作用，Short T等(1997)[6]研究发现，ESR基因的不同基因型与母猪头胎高窝产仔数相关。陈克飞等(2000)[7]研究认为，ESR基因的BB基因型母猪要比AA基因型母猪每胎多产活仔0.63～3.58头。FSHβ是垂体前叶分泌的糖蛋白，主要刺激卵泡生长发育，与促黄体素协同作用激发卵泡成熟并诱发排卵[8]。有报道显示，大多数地方猪种FSHβ大多是A等位基因占优[9-11]。

本试验结果表明，淳安花猪FSHβ也是A等位基因占优，与国内大多数报道的地方猪种研究结果一致。而淳安花猪ESR无AA基因型，BB基因型占优，提示淳安花猪具有较高的繁殖性能。

3.2淳安花猪生长性能相关基因MC4R为肽类物质，由下丘脑腹内侧核分泌，是黑皮质素受体家族的主要成员之一[12]。主要作用是通过与脑部分泌的天然内源配体α-促黑激素结合，从而达到抑制体重增加的效果[13]。这种机制深刻影响着动物的背膘厚、日增重和采食量等生长性状[14-15]。

陈敏等(2005)[16]研究发现，MC4R在地方猪种中以AA和AB基因型为主，AA基因型表现出更久的饲养期、更厚的背膘和更低的瘦肉率。GH是由垂体前叶中嗜酸性细胞合成和分泌的单链多肽激素，具有调节脂类、糖类和蛋白质代谢，促进生长等作用[17]。经荣斌等(2003)[18]认为，GH的等位基因A可能对瘦肉率呈正效应，对产仔数呈负效应。

本次试验，淳安花猪MC4R只有一种基因型AA，GH的B等位基因频率达0.97，提示淳安花猪瘦肉率较低，生长周期较长。

3.3淳安花猪肉质相关基因 猪应激综合征(PSS)是指猪在应激因子(如运输、转栏、高温、预防注射和配种等)的作用下诱发的一种综合征候[19]。这种猪往往以异常高的频率产生劣质的PSE肉，可给养猪生产带来很大的经济损失。RYR1基因又称氟烷基因，已证明为猪应激综合征发生的主效基因。有研究表明，RYR1与猪应激性及PSE肉密切相关[20-21]。

刘文举等(2008)[22]研究发现，外来猪种含应激敏感AA基因型，而地方猪种只有BB抗应激基因型。淳安花猪的研究分析结果与其基本一致，提示淳安花猪抗应激性较好。

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