ADMA与认知障碍严重程度的关系

刘 蕾， 郑秀海， 范 鹰， 高 强， 李 梅， 马 兰

理论上认知障碍包括记忆、视空间、执行功能、计算力障碍，以及失语、失用、失认、轻度认知障碍和痴呆[1]。Missotten等研究当地痴呆与非痴呆患者的生活质量，发现痴呆患者的生活质量显著下降[2]。近年来有关认知障碍的危险因素方面的研究[3]引起人们极大的关注。一氧化氮(nitric oxide,NO)是血管内皮细胞衍生的重要血管活性介质之一，主要由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)家族催化左旋精氨酸(L-arginine,L-Arg)合成，在脑血流调节和血管平滑肌细胞增殖的抑制功能中起重要作用。ADMA是由内皮细胞产生的一种内源性NOS抑制剂，可与L-Arg竞争性结合NOS活性部位，使血管活性物质NO生成减少，导致内皮功能障碍，血管呈收缩状态，血管壁平滑肌细胞增殖及脑血流调节障碍，继而导致认知障碍。本研究拟通过检测不同程度认知功能障碍组与无认知功能障碍组血中ADMA的表达水平，并对认知障碍可能的危险因素进行对比分析，希望对于认知障碍的预防、诊断及治疗有一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2013年10月-2014年7月在哈尔滨医科大学附属第二医院的老年病科及神经内科住院患者为研究对象，共收集172例，其中男99例，女73例；年龄48岁～89岁，平均(66.62±9.99)岁。入选者均签署知情同意书。入选标准：有自主行为能力，听力、视力正常可配合实验。排除标准：入组前服用激素类、血管紧张素转换酶抑制剂、降糖药、他汀类药物等其他可能影响血ADMA水平药物2 w以上；急性冠脉综合征、急性脑梗死、脑出血、癫痫、正常颅压脑积水、颅内肿瘤、颅脑外伤者；甲状腺功能减退、严重的心肺肝肾疾病患者；中枢神经系统感染、一氧化碳中毒、免疫系统疾病、放射线脑病等。

1.2 研究方法 在排除外界干扰、安静舒适的环境下，按照量表的评分标准为每个患者进行蒙特利尔认知评估北京版(MoCA)的调查，将搜集到病例的量表按评分进行如下分级。MoCA：具有很高的重测信度、内部一致性。特别强化了对执行能力和注意力的检查。强调延迟记忆。灵敏度高，特异度较低。评分标准：最高分为30分。如果受教育年限≤12 y则加1分。因各国、地区的痴呆严重程度分级不同，本实验进行以下分级，共分5组：≥26分为正常组；22～25分为1级；19～21分为2级；14～18分为3级；0～13分为4级。

1.3 一般资料采集 收集并记录患者的年龄、学历、性别、冠心病史、糖尿病史等。所有的入选患者免冠脱鞋，测量患者身高(m)、体重(kg)，计算体重指数(BMI=体重/身高2)、嘱患者取卧位，安静状态下休息10 min，于患者肱动脉搏动处用校对过的台式袖带血压计测量收缩压(SBP)、舒张压(DBP)，间隔5 min再测一次，取两次的平均值记录。

1.4 血液指标采集 所有受试者均前1 d 22：00后禁食水，空腹10 h晨起抽取肘静脉血5 ml送检，运用氧化酶法测空腹血浆葡萄糖(FPG)、直接法测低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、酶比色法测总胆固醇(TC)、比色法测甘油三酯(TG)、散射比浊法测CRP、比色法测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、酶法测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、酶法测血BUN、比色法测血Cr在日立7600全自动生化分析仪上进行。运用流式+电阻抗法测定血白细胞(WBC)，在XE5000全自动流式血细胞计数仪上进行检测。

1.5 血清ADMA测定 所有参与者抽取血另留一份血样5 ml至促凝管中，2 h内于3000 r/min条件下离心20 min后，用无菌吸管取上清血清，移至消毒EP管中，保存于-80 ℃冰箱，应用酶联免疫法测定各组研究对象中ADMA浓度。血清ADMA由北京诚林生物科技有限公司按说明书测定，操作步骤如下：标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10个，在第一、第二孔中分别加标准品100 μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50 μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100 μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50 μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50 μl弃掉，依此类推，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50 μl，混匀后从第九、第十孔中各取50 μl弃掉(稀释后各孔加样量都为50 μl，浓度分别为60 μmol/L、40 μmol/L、20 μmol/L、10 μmol/L、5 μmol/L)。加样：分别设空白对照孔(不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加入样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。加酶：每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外。温育：操作同温育。洗涤：操作同加酶。显色：每孔先加入显色剂A50 μl，再加入显色剂B50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。终止：每孔加终止液50 μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。测定：以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15 min以内进行。

2 结 果

2.1 认知障碍程度与一般情况的关系 本实验观察了性别、年龄、学历、BMI的一般情况对不同程度认知功能的影响，发现各组间年龄的差别有统计学意义(P<0.001)，随着年龄增长认知功能障碍呈加重趋势。各组间学历的差别有统计学意义(P<0.001)，认知功能障碍越重的组中，高学历的人数越少(见表1)。

2.2 认知障碍程度与血压、血糖、血脂相关指标的关系 观察血压、血糖、血脂相关指标的关系对不同程度认知功能的影响，发现收缩压(P=0.026)的差别有统计学意义，其他指标无差别(P>0.05)(见表2)。

2.3 认知障碍程度与肝肾功能/炎症反应的关系 观察肝肾功能/炎症反应对不同程度认知功能的影响，发现内生肌酐清除率(P=0.002)、ALT(P=0.01)、AST(P=0.011)的差别有统计学意义，其他指标无差别(P>0.05)(见表3)。

2.4 影响ADMA的相关因素分析 影响ADMA的多因素分析发现，年龄(P=0.000328)、卒中史(P=0.019009)和肾功能不全病史(P=0.000328)是血清ADMA浓度的独立危险因素，而且年龄、卒中史的回归系数显示与ADMA呈正相关；肾功能不全病史显示与ADMA呈负相关，而其他危险因素分析却无相关性(P>0.05)(见表4)。

2.5 各组中ADMA浓度比较 按MoCA评分分组的各组间的血清ADMA，在正常组血清浓度最低，MoCA评分1级～4级间的血清浓度逐渐升高(P=0.028)(见表5)。

表1 认知障碍程度与一般情况的关系

注：年龄组：与正常组比*P<0.05；与4级组比#P<0.05；与3级组比#P<0.05，其它组间无统计学意义。学历组：与正常组比**P<0.05；与1级组比△P<0.05，其它组间无统计学意义

表2 认知障碍程度与血压、血糖、血脂相关指标的关系

与正常组比较#P<0.05；与3级组比较*P<0.05；其它组间比较无统计学意义

表3 认知障碍程度与肝肾功能/炎症反应的关系

注：GFR：肾小球滤过率;Ccr：内生肌酐清除率。Ccr组：与4级组比*P<0.05;与3级组比#P<0.05;其它组间比较无统计学意义。ALT组：与4级组比**P<0.05;其它组间比较无统计学意义。AST组：与4级组比△P<0.05;其它组间比较无统计学意义

表4 影响ADMA的多因素分析

表5 各组血清ADMA浓度比较

与正常组比*P<0.05；与1级组比较#P<0.05；其它组间比较无统计学意义

3 讨 论

3.1 对MoCA评分有意义的影响因素 本研究发现，按MoCA评分分组，年龄(P≤0.001)在各组间的差异均有统计学意义，而且还发现在各级中，随年龄的增长，认知评分越差。国内外研究也发现随着年龄的增加，认知障碍加重。Taylor等[4]研究发现，年龄导致脑白质病，间接引起认知障碍。Petersen等[5]研究也发现随着年龄的增长，阿尔茨海默病痴呆加重，也间接证明了和认知障碍相关。老年人发生脑白质病，间接导致认知障碍，由于年龄增长而出现白质脱髓鞘改变，造成脑小血管周围间隙扩大，导致脑白质萎缩，年龄的增长使脑内小动脉出现硬化性血管改变，当循环血压下降时，硬化血管不能通过扩张保持脑白质的血液供应，从而引起脑白质慢性缺血改变[6]。

在各组危险因素中，肝功能在组间差异有统计学意义(P<0.05)，但是在认知评分低的调查者中，转氨酶较低，与预期的不一样，可能是在这些患者中，肝脏细胞功能较差，释放的酶较少，而正常人肝细胞功能正常，受损后释放转氨酶较多。转氨酶反映了肝功能受损，这也可能肝脏功能障碍导致血氨清除障碍，以及抑制性氨基酸增多，兴奋性氨基酸减少，导致神经传导障碍，间接导致患者认知障碍。在各评分分组中，内生肌酐清除率(P=0.002)的差别有统计学意义。而且内生肌酐清除率与认知评分呈正相关，即内生肌酐清除率越高，认知评分越高(见表3，P<0.05)。通常体内24 h产生约300 μmol ADMA，约有50 μmol的ADMA通过肾脏排泄[7]，因为内生肌酐清除率反应肾小球滤过功能，故在肾小球滤过功能减退时，ADMA经肾脏排泄减少，减少NO水平，使内皮功能失调，间接促进认知障碍的发生发展。Kurella等研究也发现，慢性肾脏病的患者脑电潜伏期明显延长，而且脑电潜伏期越长，认知评分越低，故也间接证明了肾功能减退间接可以导致认知障碍的发生[8]。

本研究显示，在按MoCA评分分组中，收缩压在各级评分中组间有统计学意义(P=0.026)，高血压导致认知障碍的可能机制是高血压导致全身小动脉痉挛、内皮损伤、血管壁重构、透明样变性、血管壁增厚、血管腔狭窄，导致脑供血减少。影响血管分支终末分布区的脑白质及基底节区，随后的亚临床脑白质缺血事件导致进行性加重的脑白质疏松和神经纤维脱髓鞘改变，继而引起基底节区功能障碍以及基底节与皮质之间的联系中断。流行病学研究证明了高血压与痴呆发生的相关性。欧洲收缩期高血压研究(systolic hypertension in Europe,Syst-Eur)发现了高血压治疗组，2 y后的痴呆发病率减少了55%。但是在32例新发痴呆患者中，只有2例血管性痴呆，因此，不能证实通过降压治疗来减少血管性认知障碍发生[9]。鹿特丹研究(Rotterdam study)[10]发现，与对照组相比，抗高血压治疗组发生血管性痴呆，相对危险性下降1/3。高龄老年人认知功能评估研究(hypertension in the very elderly trial cognitive function assessment，HYVET-COG)是一项有中国参加的多中心研究，将它的研究结果与其他3项类似研究结果荟萃分析后，结果发现，通过降低血压能够改善痴呆的发生率[11]。通过以上的研究结果发现，降压治疗能改善患者的认知功能或者防止认知功能的下降，从而对认知障碍的发生起到抑制作用。

3.2 ADMA与MoCA评分 本研究显示按MoCA评分分组的各组间血清ADMA浓度有统计学差异(P=0.028)，并且随着评分的降低，血清ADMA浓度逐渐增高；在一个随机、双盲、安慰剂对照的临床研究中，研究人员将ADMA经静脉注入健康自愿者体内，比较注射ADMA与安慰剂组，结果ADMA显著降低脑灌注及血管顺应性。证明ADMA在痴呆发病中起到了一定的作用[12]。ADMA作为NOS的内源性抑制剂，抑制NO合成，增加氧自由基形成，促进血小板活化和聚集[13]，单核细胞粘附[14]，加速内皮细胞凋亡，导致内皮功能紊乱[15]。正常的脑血管内皮细胞对于维持脑血流自我调节功能和血脑屏障极其重要[16]，目前认为血脑屏障受损、脑血流自动调节障碍和慢性低灌注是脑白质病的重要发生机制，进而导致出现认知功能障碍。White等[17]在NOS抑制剂对脑血流自身调节的研究中，证明了NO参与脑血流动力学的自我调节，它的释放减少损伤脑血流自我调节，可能减慢脑血流量。Corzo等[18]通过研究发现由HDL-胆固醇介导的NO有助于减慢痴呆的进展，目前机制尚不清楚，可能是HDL刺激激酶级联和钙离子的激活、反应性星形胶质细胞的形成，进而诱导iNOS。减少的NO水平可加重脑血流量功能障碍、突触破坏和增加氧化应激，间接促进痴呆的发生。

3.3 影响ADMA的危险因素 本研究多因素分析显示，年龄(P=0.000328)、卒中史(P=0.019009)和肾功能不全病史(P=0.000328)是血清ADMA浓度的独立危险因素，而且年龄、卒中史的回归系数显示与ADMA呈正相关，肾功能不全病史显示与ADMA呈负相关，而其他危险因素分析却无相关性(P>0.05)。而国内外学者研究认为，血清ADMA浓度与肾功能、冠心病、高血压病、脑卒中等危险因素有关[19,20]，并且发现伴有上述疾病史时，血清ADMA浓度增高。但本研究却没有发现此规律，可能是在多因素分析时自变量较多，互相影响，导致分析结果受影响所致。

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