基于ISSR标记的油茶种质资源遗传基础分析

姜德志+方应有+肖贤

摘要：以油茶（Camellia oleifera Abel.）主产区的109个种质材料为试材，采用简单序列重复区间分子标记（ISSR）和非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚类分析，研究了这109个油茶种质材料遗传相似系数及亲缘关系分析，并构建了其进化树关系。结果表明，①从49条ISSR引物中筛选出23条能够扩增出清晰，稳定条带的引物，23条引物共扩增出487条带，其中多态性条带有335条，多态性条带比率为68.79%；②应用NTSYS2.10e软件对扩增结果进行UPGMA法聚类分析，109个油茶种质材料的遗传相似系数从0.61到0.93；③油茶种质资源丰富，遗传相似系数在0.735时，可将109个油茶种质材料划分为11个类群。类群I包括79个种质材料，该类群在相似系数为0.75处又可划分为7个亚类群，且这些油茶种质材料间的亲缘关系较近。但由聚类分析划分的油茶类群来看，这些油茶材料的遗传背景又比较复杂，具有丰富的遗传多样性。分析结果可为油茶主产区的品种资源开发、基因资源保存、后期品种审定及鉴别提供理论依据。

关键词：油茶（Camellia oleifera Abel.）；种质资源；简单序列重复区间标记；遗传多样性

中图分类号：S794.4+95：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）02-0119-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.030

Abstract： 109 germplasm materials of Camellia oleifera Abel in the main producing areas were analyzed using inter simple sequence repeat markers（ISSR） and Unweighted pair-group method with arithmetic means （UPGMA） cluster analysis method to study the genetic correlation coefficient and genetic relationship， and constructe the phylogenetic relationship. The result showed that， （1） 23 primers with clear and stable bands were screened from 49 ISSR primers， and 487 bands were amplified by the 23 primers， of which 335 bands were polymorphic，and the polymorphic bands ratio was 68.79%.（2） NTSYS2.10e software was used to cluster the amplified results by UPGMA method； and the genetic similarity coefficients of 109 C. oleifera germplasm materials were from 0.61 to 0.93. （3） The germplasm resources of C. oleifera were rich. When the genetic similarity coefficient was 0.735， the 109 C. oleifera germplasm materials could be divided into 11 groups. The group I includes 79 germplasm materials， which can be divided into 7 sub groups at the similarity coefficient of 0.75， and the genetic relationship among these C. oleifera germplasm materials is closer. However， the genetic background of these C. oleifera germplasm materials is complex and rich in genetic diversity. The analysis results can provide theoretical basis for germplasm resources development， genetic resources conservation， late variety certification and identification in C. oleifera major producing areas.

Key words： Camellia oleifera Abel.； germplasm accessions； inter simple sequence repeat； genetic diversity

油茶（Camellia oleifera Abel.）為山茶科（Theacea）山茶属（Camellia L.）植物[1]，是适应性强、分布广泛的木本油料树种，具有重要的经济、社会和生态价值[2]。中国油茶种质资源极为丰富，各油茶产区都选育出了大量的优良单株、无性系和家系，全国共选出 200多个优良无性系[3]。但是由于遗传背景与环境的影响，众多无性系的形态特征出现了较大差异，导致油茶品种名称混乱，同名异物、同物异名的现象时有发生[4]。因此，从分子水平上对油茶品种及新选育品系进行种群关系鉴别十分必要。现在分子标记技术发展快速，其在油茶研究中的应用也越来越广泛[5]。简单序列重复区间标记（Inter simple sequence repeat，ISSR）是类似随机扩增多态性DNA标记（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）的一种聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术，是近几年在微卫星分子标记基础上发展起来的一种新型分子标记技术[6]。利用ISSR技术能够检测出较多的DNA多态性[7]。ISSR标记能有效揭示种群内的遗传多样性，进而分析其系统分化规律，研究群体遗传结构及其多样性程度[8]。ISSR技术极易受模板，引物以及Taq酶等因素的影响，任何一个因素的改变都可能使扩增产物发生变化[9]。因此需要对油茶ISSR分子标记的反应体系进行优化，才能使得到的结果更加精准。试验选用ISSR技术探讨国内的油茶种质资源遗传相似性，以湖北省林业科学研究院油茶种质资源基地保存的油茶种质材料叶片为供试材料，旨在更快速、准确、简便的鉴定这些材料间的亲缘关系，从分子水平上为湖北省油茶种质资源的收集、鉴定和发展提供参考依据。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料为在全国油茶主产区采集的油茶种质材料，包括品种、优树等，共109个样品，各材料样品编号见表1。每个样品随机选取10～20片幼嫩叶片，采摘后装入做好标记的自封袋中，于-80 ℃冰箱中冷冻保存。

1.1.2 主要试剂 CTAB提取DNA试剂、30%聚丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、硝酸银、氢氧化钠、甲醛、无水乙醇、冰醋酸、亲和硅烷、剥离硅烷等购自武汉宏博生物有限公司；琼脂糖、5×TBE缓冲液、2×Taq PCR Master Mix购自北京天根生化科技有限公司；Maker DL2000购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油茶基因组DNA的提取与检测 参考杨翠芳等[10]和阙生全等[11]的CTAB法，略做改进，提取109个油茶种质材料叶片的总基因组DNA。于0.8%的琼脂糖凝胶中电泳，检测所提基因组DNA的质量，用紫外分光光度计检测DNA浓度，提取的总DNA保存于-20 ℃冰箱，备用，-4 ℃为短期存放条件。

1.2.2 引物来源及ISSR-PCR扩增反应体系的建立 试验所用引物是依据油茶的EST文库筛选出的ISSR序列，参照加拿大哥伦比亚大学网站公布的ISSR引物序列，共设计出49条扩增引物（SSR1～SSR49），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ISSR-PCR扩增反应体系设为20 μL，包括2×Taq PCR Master Mix反应液（Tag Polymerase 0.1 U/μL、500 μmol dNTP each、20 mmol Tris-HCl、100 mmol KCl、3 mmol MgCl2及其他稳定剂和增强剂）10 μL、引物2 μL、DNA模板50 ng、ddH2O 6 μL。扩增程序设为94 ℃预变性3 min；然后94 ℃变性30 s，50～56 ℃退火40 s，72 ℃ 3 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min[12]。

1.2.3 引物筛选 选用基因组DNA纯度较高的油茶样品为模板，分别对49个引物采用以上扩增程序进行PCR扩增。扩增产物先用1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测，再用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析，筛选出的多态性较高的引物用于109个油茶样品的鉴定[9]。

1.3 数据统计与分析

将选扩的PCR产物全部上样6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，在30 V/cm电压下电泳约90 min，经硝酸银染色，氢氧化钠显影，所获得的扩增条带以0、1统计建立数据库。同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性[13]。条带统计以其清晰可重复为基本原则，采用人工读带法，在相同迁移位置上，有带的记为1，无带的记为0。在NTSYS 2.10e分析软件中，根据SM相似系数法求得油茶种质材料间的遗传相似性矩阵，再用非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）进行聚类分析，构建系统聚类分析树状图[14]。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

试验随机选取油茶2个种质材料AH18和XL51的DNA为模板，分别对49条ISSR扩增引物进行筛选，淘汰无扩增产物和多态性差的引物，选留扩增条带清晰且有明显多态性片段的引物，结果见图1、图2。从图1、图2可见，在引物SSR8、SSR9、SSR13、SSR14、SSR15、SSR16、SSR17、SSR18、SSR20、SSR25、SSR30、SSR32、SSR36、 SSR38、 SSR43、 SSR45中均有多态性条带，说明对应编号的引物都可为ISSR引物筛选提供参考。而对其他泳道没有显示多态性条带的引物予以淘汰。结合聚丙烯酰胺电泳进一步分析，结果见图2。从图2可见，引物SSR7、SSR8、 SSR9、 SSR13、 SSR14、 SSR19、 SSR20、 SSR21、SSR28、SSR29、SSR32、SSR33、SSR34、SSR36的多态性条带数清晰，再结合图1初步筛选的结果，确定23条引物（表2）用于109个油茶种质材料的认证和鉴定。这些引物均能在供试油茶样品中扩增出清晰、稳定、重复性和多态性较高的条带。

2.2 ISSR多态性分析及指纹分析

用筛选出的23个引物分别对109个油茶种质材料提取的基因组DNA进行PCR扩增，共扩增出487条DNA条带，平均每个引物扩增出21.2个条带，其中多态性条带有335条，平均每个引物扩增出14.6个多态性条带，平均多态性位点百分率为68.79%，具体见表2。从表2可见，不同引物扩增出的条带数有较大差异，引物ISSR13，ISSR36扩增出的条带较多，分别为27、28条；引物ISSR9，ISSR10扩增出的条带数最少，均为16条。引物ISSR18、ISSR28和ISSR36擴增出的多态性条带最多，均为20条。用这23条引物分别建立了相应的DNA指纹图谱，限于篇幅，这里用引物SSR36的扩增结果图3、图4作为代表来分析之，其引物扩增效果所反映出的DNA条带多态性可较好地区分各油茶种质材料。

2.3 油茶品种间的遗传相似性分析

用NTSYS2.10e软件计算油茶种质材料间的Dice遗传相似系数，结果见表3（因篇幅关系，省略了一部分附表，仅以表3为例）。由表3可知，109个油茶种质材料间的遗传相似系数在0.61～0.93，平均遗传相似性系数为0.74。以59号样品（S13）和60号样品（S12）的遗传相似性系数最大，为0.93，说明这2个样品的亲缘关系很近，有可能为同一品种。其次是4号样品（赣无16）和6号样品（赣无2号），相似性系数为0.87，表明它们之间的亲缘关系很接近，遗传差异较小。而14号样品（XL53）与15号样品（湘林210）具有最小遗传相似性系数，为0.61，可见它们遗传差异较大，2个样品间的亲缘关系相对较远。endprint

2.4 聚类分析

在获得两两不同样品间的Dice遗传相似系数基础上，以487个位点的谱带为原矩阵，采用UPGMA法构建了油茶种质材料间的遗传关系聚类图谱，具体见图5。在图5聚类分析树状结构中，可以看到109个油茶种质材料的分类情况。树状图与种质材料间的遗传相似系数反映的情况基本一致，即遗传相似系数越高，亲缘关系越近，种质材料间差异就越小。109份种质材料间的相似系数在0.70～0.93，表现出了丰富的遗传多样性。

根据油茶ISSR聚类分析结果，说明亲缘关系树状图较复杂，当遗传相似系数为0.70时，109个种质材料可分为A、B两组，B组中15号样品湘林210可单独聚类，说明该种质材料与其他种质材料间存在遗传差异。

当遗传相似系数为0.735时，可将油茶种质材料划分为11个类群。类群I包括的样品材料较多，有79个。该类群在相似系数为0.75处又可以划分为7个亚类群。其中亚类群I-1包括14个种质材料，该亚类群又可分为两个小组，第二小组聚类了6个种质材料，其中有4个是QY系列的；第一小组聚类了8个种质材料，其中来自S系列的59号和60号样品的遗传相似性系数最大，为0.93，说明这两个种质材料的亲缘关系很近，有可能为同一品种。亚类群I-2包括27个样品，有7个是赣系列的。亚类群I-3包括4个种质材料，来自赣无系列的4号和6号样品聚类在一起，遗传相似系数为0.87，说明他们的亲缘关系接近，遗传差异较小。亚类群I-4包括湘林7、XL32、QY235、AH12、长林3、QY104这6个种质材料。亚类群I-5包括24个样品，其中有8个来自赣系列。亚类群I-6只有来自S系列的S8和S6两个样品。亚类群I-7只有XLC25和AH19两个样品。

类群Ⅱ包括5个种质材料。类群Ⅲ包括4个种质材料，其中有3个是赣系列的。类群Ⅳ包括3个种质材料，其中有2个来自赣系列。类群Ⅴ、类群Ⅵ和类群Ⅶ均包括3个种质材料。而类群Ⅷ和类群Ⅸ分别只有S3、茶花各1个样品。类群Ⅹ包括6个样品，其中有5个样品是XL系列的。类群Ⅺ则只有湘林210这一个样品。

3 讨论

3.1 ISSR标记和引物筛选

遗传标记是作物遗传育种研究的重要工具之一，ISSR以其设备技术简单、重复性高、多态性丰富的特点已在果树起源进化及系统分类研究方面发挥着重大作用[15]。试验中由49对引物最终仅筛选出23对多态性高的引物，筛选效率一般，引物筛选率为46.9%，可能来自两方面的原因，一是EST数据较少，来源单一，所设计的引物本身就存在较高的冗余度；二是中国油茶种质材料之间亲缘关系较近，不易得到有多态性的引物[16]。

3.2 遗传多样性分析

多态位点百分率是衡量物种遗传变异水平高低的一个重要指标，是衡量遗传多样性的重要参数[17]。张婷等[18]对湖北省5个地区的48个油茶资源进行了遗传多样性分析，将湖北省主要油茶栽培品系分为两大类群，恩施州的鹤峰居群为一类，其他地区居群为一类。

在亲缘关系分析方面，Huang等[19]利用RAPD标记技术，用18条引物分析了90个油茶无性系的遗传多样性，结果扩增谱带中的多态性谱带比率高达95.11%；彭方仁等[20]利用ISSR技术用10个引物对192份油茶种质材料进行了鉴别，结果多态性百分率为88.14%；代惠萍等[21]利用ISSR分子标记技术，用11个引物对秦巴山区的32个油茶品种进行了扩增，结果多态性位点比率为60.28%；本试验利用ISSR分子标记技术，用23个引物对109个油茶种质材料进行扩增，所得到的多态性比率为68.79%，表明供试油茶种质材料之间存在着较大程度的遗传变异，具有丰富的遗传多样性。这与湖北省油茶种质资源丰富、油茶分布地区广及油茶长期的异花授粉造成的遗传背景高度复杂等因素有关。

3.3 油茶亲缘关系的聚类分析

试验发现，聚类分析中部分地理来源相同或遗传背景相似的种质材料能够聚在同一类群里，但也有一些地理来源及遗传背景不一致的种质材料也能聚集在同一类群，显示出了复杂的亲缘关系。可能的原因一是油茶已有悠久的栽培历史，在长期的生产中，各油茶产区遗传资源在不断交流所致[2]；二是种质材料数量不均匀，此次采集的样品中赣系列有24个，XL系列有20个，长林系列、S系列和AH系列均有10个，QY系列有9个，鄂油系列有8个，其他的更少，甚至有的系列只有1个，如华硕，这导致聚类结果的不规律；三是油茶具有异花授粉的特性，这导致了种质材料高水平的遗传多样性[22]。

试验中，109个油茶种质材料利用 ISSR分子标记得到的聚类分析图从总体上看似乎有点杂乱，这主要是由于样品数量繁多所造成的；从单个的油茶品种（优树）系列来看，赣系列、XL系列、长林系列以及QY系列等能清晰地建立遺传图谱，鉴别其亲缘关系的远近。如赣系列中，聚类在亚类群I-3中的赣无16和赣无2号的亲缘关系最近，遗传相似系数为0.87；赣无5、赣无11、赣兴46、赣石84-8、赣无24、赣永6和赣无20的亲缘关系较近，在亚类群I-2中聚在一起；赣无1、赣68、赣8、赣6、赣70、赣兴48、赣190和赣石83-4的亲缘关系较近，在亚类群I-5中聚在一起。又如XL系列中，XLC26、XLC4、XL36、XLC6和XLC8的亲缘关系较近，在类群X中聚在一起；S系列中，S1、S6、S8、S10、S11、S12、S13和S17的亲缘关系较近，在类群I中聚在一起，其中在亚类群I-1中的S13和S12的亲缘关系最近，遗传相似系数为0.93。当然，由于条带判读具有主观性、某些条带扩增效果不明显等原因会使鉴定结果可能存在偏差，这需要更多的试验来验证。

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