柑橘皮中总黄酮提取工艺及降血糖活性的试验研究

（湘潭医卫职业技术学院，湖南湘潭411102）

糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病。长期血糖增高，大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病，严重影响了患者的身心健康。而化学方法合成的抗糖尿病药物对人体副作用大，着手从天然产物中研制降血糖药物，是目前学者热衷研究的方向之一[1]。在治疗糖尿病的天然产物中，黄酮类成分扮演着重要的角色[2]。

柑橘皮作为传统的中药，其中的黄酮类物质含量丰富，主要包括黄烷酮、黄酮和多甲氧基黄酮等3类物质[3]，其中以黄烷酮苷为主。现代药理研究表明，柑橘黄酮具有抗氧化、抗菌与抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂及增强免疫力等活性[4-8]。近年来对柑橘黄酮的药理作用研究较多，但对柑橘黄酮类物质的降血糖作用研究较少。本文对柑橘皮中总黄酮的乙醇提取工艺及辅助降血糖作用进行了研究，试验结果能为柑橘皮的进一步开发和应用提供依据。

1 试验材料

1.1 原料

柑橘：购买于湖南芦溪县某农贸市场，产地为湖南芦溪县。

1.2 试剂

芦丁对照品（含量为92.8%，中国食品药品检定研究院，100080-201407）；四氧嘧啶（北京中生瑞泰科技有限公，型号：1122）；盐酸二甲双胍片（深圳市中联制药有限公司）；注射用生理盐水（天津药业焦作有限公司）；乙醇、其余试剂、试药均为分析纯。

1.3 仪器

UV2600双光束紫外分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；BP211D赛多利斯分析天平（十万分之一）：德国sartorius赛多利斯；XL-600B多功能粉碎机：永康市小宝电器有限公司；KQ3200DB数控超声波清洗仪：昆山超声仪器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；ER-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器；强生稳豪倍优型血糖仪及配套试纸。

1.4 试验动物

雄性SPF级ICR小鼠，清洁级，4周～5周龄，体重20 g～25g，购买于湖南斯莱克景达试验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2017-0002。

2 试验方法

2.1 原料预处理

将柑橘洗涤后剥皮，再把椪柑皮晾干后烘干至恒重。采用多功能粉碎机粉碎，过60目筛，备用。

2.2 提取工艺条件的确定

根据黄酮易溶于乙醇等性质，该试验选择乙醇回流提取法。为了确定柑橘皮中总黄酮的最佳提取工艺，参考了相关文献资料[9-11]，结合笔者以往的研究经验，分析得出影响天然药物中总黄酮提取率的主要因素有乙醇浓度、溶剂用量、提取时间和提取温度。本试验采用乙醇浓度（%）、溶剂用量（倍）、提取时间（h）作为考察对象，设计三因素三水平正交试验优选最佳提取工艺条件。由于天然药物活性成分的提取次数一般为2次，所以本次试验设定提取次数为2次。每次提取的水浴温度均设定为85℃[12]。因素水平表见表1。

表1 因素水平表Table 1 The factor and level experiment

2.3 柑橘总黄酮的测定

2.3.1 芦丁标准曲线的绘制[13]

精密称定芦丁对照品5.46 mg置25 mL量瓶中，加一定量无水乙醇溶解，冷却至室温，再加无水乙醇至刻度，得0.218 4（mg/mL）的芦丁对照品溶液。

精密量取对照品溶液 0、2、3、4、5、6、8 mL，分别置25 mL容量瓶中，各加无水乙醇补足至5.0 mL，各加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，静置6 min，再加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀、静置6 min，再4%氢氧化钠试液10 mL，再加无水乙醇至刻度，摇匀，静置15 min。以空白试剂作对照液，用双光束紫外分光光度计在510 nm的波长处测定吸光度，以对照品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标得到标准曲线：Y=13.495X-0.0196（R2=0.999 6），式中：Y 为吸光度；X为芦丁浓度，mg/mL。

2.3.2 柑橘皮中总黄酮提取率计算

按照2.2项下在不同条件下水浴提取得到的提取液，每次提取液趁热过滤，合并提取液，浓缩、定容至250 mL的容量瓶中。取5 mL提取液，用无水乙醇定容至25 mL容量瓶中，按“2.3.1”方法测定吸光度，平行试验3次，结果取平均值。查标准曲线，得到总黄酮浓度，即可计算柑橘皮中总黄酮提取率。

总黄酮提取率的计算公式：

式中：C为稀释液总黄酮浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；W为样品重量，g；v为测定的样品体积，mL；N为稀释倍数。

2.4 柑橘皮黄酮对小血糖影响试验

2.4.1 柑橘皮总黄酮的制备

称取2.1项下已粉碎的柑橘皮20 g放入圆底烧瓶中，按照2.2项下确定的最佳提取工艺条件提取2次，每次提取液趁热过滤，合并提取液；经旋转蒸发仪，在温度为65℃下回收乙醇，回提后得到剩余液体约120 mL，再经水浴蒸发，得浸膏；再将浸膏放于45℃烘箱中干燥，得到粉末状柑橘皮70%乙醇提取物。

2.4.2 糖尿病小鼠模型的建立

对糖尿病小鼠模型的建立参照文献[14-15]方法并稍做修改，方法如下：取ICR小鼠100只，雄性，体重为20 g～25 g，适应性饲养3 d，称重。随机挑选12只小鼠作为空白对照组，其余小鼠禁食12 h（自由饮水），200 mg/kg剂量下腹腔注射四氧嘧啶生理盐水溶液（空白对照组注射等体积生理盐水），建立糖尿病动物模型。72 h后再次禁食（不禁水）12 h，于后尾静脉采血，血糖仪测定空腹血糖值，血糖值≥11.1（mmol/L）为糖尿病模型小鼠。

2.4.3 柑橘黄酮对糖尿病小鼠模型血糖影响试验

柑橘黄酮对糖尿病小鼠模型血糖影响试验参照文献方法[16-17]并稍做修改，方法如下：选取糖尿病模型小鼠60只，按血糖值随机分成5组，即二甲双胍阳性组，模型组、柑橘皮70%乙醇提取物高、中、低3个剂量组。二甲双胍阳性组，将二甲双胍片碾碎成粉末状溶于生理盐水中，制成10.2 mg/mL质量浓度的溶液，按0.1 mL/g给与灌胃；柑橘皮70%乙醇提取物高、中、低3个剂量组给药浓度为：称取2.4.1项下制得的干粉5.0、3.0、1.0 g/kg质量浓度配成生理盐水溶液，按照0.2（mL/g）给予灌胃；模型组和空白对照组给予等体积的生理盐水。每天灌胃给药1次，连续14 d。分别在灌胃给药第7天及第14天于尾静脉取血，用血糖试纸及血糖仪测定其血糖质量浓度的变化。

2.4.4 统计学方法

将试验数据输入电脑软件，采用SPSS15.0软件进行统计学分析。P＜0.05为差异有显著性。

3 结果与分析

3.1 提取工艺技术条件

按照2.3.2项下测定柑橘皮中总黄酮的含量，测定结果见表2。由表2可看出，各因素对柑橘皮中总黄酮得率的影响从大到小依次为乙醇浓度、提取时间、料液比。从各因素水平看，A2、B3、C3组合提取率应最大。但此组合不在正交试验中，做验证试验。试验结果是：在该组合下，柑橘皮中总黄酮提取率为7.68%。由此优化出柑橘皮中总黄酮的最佳提取工艺为70%乙醇，料液比为1∶20（g/mL），回流提取2次，每次2 h，提取温度设定为85℃。

表2 试验结果及分析表Table 2 Test results and analysis table

3.2 柑橘总黄酮对四氧嘧啶所致高血糖模型小鼠空腹血糖的影响

柑橘总黄酮对四氧嘧啶所致高血糖模型小鼠空腹血糖值的影响见表3。由表3可以看出，柑橘黄酮对空白对照组小鼠的血糖几乎没有影响，也就是说对正常小鼠的血糖值几乎没有影响；阳性组（二甲双胍组）200 mg/kg剂量能显著降低正常小鼠的血糖，阳性组与空白对照组相比较有显著差异性（P＜0.05）；柑橘皮70%乙醇提取物高、中剂量组相比较无显著性差异（P＞0.05）；柑橘皮70%乙醇提取物高、中剂量组与阳性药物相比较无显著性差异（P＞0.05）；柑橘皮70%乙醇提取物低剂量组与模型组相比较无明显差异，可能是剂量太低导致效果不是很明显。试验结果表明，柑橘皮70%乙醇提取物对四氧嘧啶所致的糖尿病小鼠模型有一定的辅助降血糖作用，而且有剂量的依赖性。

表3 柑橘总黄酮对糖尿病模型小鼠血糖值的影响Table 3 The effect of total flavonoids form citrus on blood sugar level of Diabetic Mice

4 讨论与结论

柑橘类黄酮是一系列具有显著生物活性的黄酮类化合物所组成的混合物，不但具有独特的芳香性、良好的水溶性和显著的药理作用，而且是一类新发现的营养素。柑橘皮作为传统的中药，其辅助降血糖的作用受到了研究者的关注[18-19]。该研究结果也表明，柑橘皮中总黄酮具有降低四氧嘧啶所致高血糖模型小鼠血糖的作用。目前，大致认为柑橘黄酮降血糖机制主要是与抗氧化性正相关的自由基、脂质过氧化和低密度脂蛋白氧化性改变有关[19-20]，而且试验研究还停留在在动物试验阶段。关于柑橘黄酮降血糖的浓度与范围、作用机理和作用靶点还亟待进一步研究。

除了对总黄酮的降血糖作用外，该试验还研究了柑橘皮中总黄酮的提取工艺，得到其最佳提取工艺条件为：70%乙醇，料液比为 1 ∶20（g/mL），回流提取2次，每次2 h，提取温度85℃，在此最佳工艺条件下柑橘皮总黄酮提取率7.68%。至于提取次数和提取温度对柑橘皮中总黄酮的提取率的影响也有待进一步研究。

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