白消安对小鼠造血干细胞功能的损伤作用

李程程，管博文，苏 路，党 女，王玉全，孟爱民*

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，国家卫生和计划生育委员会人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

骨髓抑制是肿瘤化疗导致的剂量限制性毒副作用，表现为造血障碍，其中以白细胞特别是中性粒细胞减少最常见，其次是血小板减少。严重骨髓抑制时可合并感染、出血，危及生命安全[1]。骨髓抑制分为急性骨髓抑制和长期骨髓抑制，急性骨髓抑制主要是电离辐射或化疗药物引起的造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)和少量的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)凋亡，以及诱导HPCs增殖障碍。临床上，可以给予造血细胞因子缓解症状[2]。长期骨髓抑制主要是HSC的损伤，长期骨髓抑制具有迟发性、隐匿性，在临床上容易被忽视，目前尚无有效治疗手段[3]。前期的研究表明，电离辐射可以诱导造血干细胞损伤，诱导长期骨髓抑制，诱导氧化应激增加，提高磷酸化p38 MAKP表达，进一步诱导造血干细胞衰老[4]。电离辐射诱导的急性和长期造血系统损伤模型广泛应用与造血辐射损伤机制的研究中。白消安目前临床上被用作慢性粒细胞白血病的缓解性治疗，或联合其他药物作为慢性髓性白血病同种异体的造血祖细胞移植前的预处理方案，清除受体体内的造血干细胞。其主要的副作用即为骨髓抑制[5]。相较于电离辐射诱导损伤模型需要特定的设备和专业人员操作，利用化疗药物白消安诱导造血干细胞损伤模型，操作简便，小鼠耐受性好[6]，本实验利用流式技术测定骨髓造血干细胞，造血祖细胞和长其造血干细胞的比例；体外单细胞培养技术评价造血干细胞功能。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57小鼠35只，体重18～20 g，6～8周龄，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供[SCXK(京)2014-0004]。饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所屏障环境动物房[SYXK(京)2015-0035]，实验方案通过医学实验动物研究所实验动物管理和使用委员会(IACUC)审批，IACUC号为：MAM16003。

1.2 主要试剂及仪器

白消安(busulfan)购自于Sigma公司；流式所需CD4、CD8、 B220、Ter119、Gr1、CD11b、Streptavidin、scal-1、ckit、CD34抗体均购自BD Bioscience公司；甲基纤维素培养基(MAM HS001)购自Gibco公司；甲基纤维素半固体培养基MethoCult GF (M3534)购自Stem Cell公司。

BD流式细胞仪(BD FACSAria TMII)；全自动血细胞计数仪(ABX Pentra DX 120，法国)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及给药

观察不同给药剂量对小鼠造血系统影响，分为对照组，低剂量给药组(20 mg/kg)和高剂量给药组(40 mg/kg)，每组5只。观察不同给药时间对小鼠造血系统影响，分为对照组，高剂量给药组(40 mg/kg)，每组10只。白消安粉末由DMSO配置为80 mg/mL作为母液贮存，使用时用PBS稀释为所需浓度。腹腔注射，高剂量给药组分两天给药，每天给予20 mg/kg。对照组小鼠给予等体积含5% DMSO的PBS作为对照。

1.3.2 造血干细胞和造血祖细胞比例测定

分离的骨髓细胞，调整细胞浓度到1×107/mL，每只小鼠取100 μL细胞用于后续染色。按体积比1∶50加入biotin标记的混合一抗抗体CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、CD11b， 4℃条件下孵育30 min，PBS洗涤一次，离心条件为1400 r/min 5 min。离心后弃去上清，保持100 μL体积，加入混合抗体streptavidin(percp标记)，scal-1(PE标记)，ckit(APC标记)，CD34(FITC标记)。4℃条件下孵育1 h。之后PBS洗涤两次，离心条件如上。BD流式细胞仪检测造血祖细胞(Lin-c-kit+Sca1-or LKS- cells)，造血干细胞(Lin-c-kit+Sca1+or LKS+cells)，长期造血干细胞(CD34-Lin-c-kit+Sca1+)在骨髓中所占的比例。

1.3.3 骨髓细胞计数

小鼠分组和给药方式如上述，白消安给药后15 d小鼠二氧化碳安乐死，75%酒精浸泡消毒，之后在无菌的条件下取小鼠单侧股骨，用含2% FBS的PBS缓冲液冲洗骨髓，将单侧股骨冲洗至2 mL EP管中，保持体积为1 mL，每只小鼠取10 μL用于骨髓细胞计数。

1.3.4 粒细胞集落形成能力测定(colony forming unit-granulocyte and macrorophage，CFU-GM)

CFU-GM实验参考前期发表文献[7]，CFU-GM实验通过检测粒细胞巨噬系细胞的集落形成能力，用来检测造血祖细胞分化为粒细胞巨噬细胞的能力。无菌取小鼠骨髓细胞，用PBS将小鼠骨髓浓度调整至4×105/mL，每个样加0.2 mL细胞至事先分装好的2 mL M3534培养基中，振荡器充分混匀，静置2～5 min，待气泡消失。加入24孔板，每孔0.5 mL。轻摇培养板，使培养基均匀分布。将培养板放入湿盒，置入37℃，5% CO2培养箱中。培养第7天在倒置显微镜下观察。低倍观察集落形成情况，细胞数≥50 为阳性集落。

1.3.5 外周血计数

小鼠的分组和给药方式如上，给药15 d后小鼠二氧化碳安乐死，摘眼球取血，用抗凝管收集外周血。自动血细胞计数仪测定外周血中白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)和血小板(PLT)等指标。

1.3.6 单细胞集落能力检测

注：与对照组相比，*P< 0.05。图1 白消安对C57小鼠外周血计数的影响Note.Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.1 Busulfan decreased the number of peripheral blood

本方法依据前期发表文章[8-9]，分离的骨髓细胞，调整细胞浓度到1×107/mL，每只小鼠取100 μL细胞用于后续染色。按体积比1:50加入biotin标记的混合一抗抗体CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、cd11b，4℃条件下孵育30 min，PBS洗涤一次，离心条件为1400 r/min，4℃，5 min。离心后弃去上清，保持100 μL体积，加入混合抗体Streptavidin(percp标记)，scal-1(PE标记)，ckit(APC标记)，CD34(FITC标记)。4℃条件下孵育1 h。之后PBS洗涤两次，离心条件如上。流式细胞仪分选长期造血干细胞(CD34-Lin-c-kit+Sca1+)到提前加了100 μL甲基纤维素培养基的96孔板中。每个孔两个细胞，待接种分选造血干细胞，37℃，5% CO2培养箱培养15 d，低倍观察集落形成情况，细胞数≥50 为阳性集落，结果计算每组阳性孔比例。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 白消安降低小鼠外周血计数

给药后15 d，检测小鼠的外周血计数。实验结果如图1所示，给予白消安的小鼠外周血中WBC，PLT的数目与对照组小鼠相比显著降低(P< 0.05)，40 mg/kg白消安给药组比20 mg/kg白消安给药组小鼠WBC和PLT数目降低更多。外周血中的红细胞和血红蛋白数目各组间差异无显著性。实验结果表明，高剂量白消安和低剂量白消安均引起C57小鼠外周血中白细胞和血小板数目降低，损伤造血系统功能。高剂量组损伤程度更严重。

2.2 白消安对小鼠骨髓计数和体重的影响

结果显示，与对照组相比，白消安给药组小鼠的体重差异无显著性。小鼠体态正常，未发现弓背和萎靡的症状。小鼠骨髓细胞计数结果显示，给药后15 d，给药组小鼠的骨髓有核细胞计数与对照组相比，未见明显变化(P> 0.05)。结果表明白消安对骨髓有核细胞数目无明显影响。(见图2)

2.3 白消安降低C57小鼠造血干细胞比例

为探究白消安对C57小鼠造血系统损伤作用，小鼠给药后15 d，用流式细胞仪检测小鼠的骨髓细胞，流式细胞仪分析时门的设置如图3所示。我们检测了造血祖细胞(lineage-scal-1-ckit+，HPC)，造血干细胞细胞(lineage-scal-1+ckit+，HSC)，长期造血干细胞(lineage-scal-1+ckit+CD34+，LT-HSC)的比例和数目。实验结果如图3所示，给予低剂量白消安小鼠HPC，HSC，LT-HSC的比例与对照组小鼠相比分别下降20.84%(1.084±0.182 vs 0.858±0.122)，47.05%(0.340±0.054% vs 0.180%±0.044%)和49.80%(0.038±0.009 vs 0.019±0.008)；给予高剂量白消安小鼠HPC、LSK、HSC的数目与对照小鼠相比分别下降51.84%(1.084±0.181 vs 0.522±0.132)，70.59%(0.340±0.054 vs 0.100±0.001)和69.38%(0.038±0.009 vs 0.011±0.002)(P< 0.05)；以上的实验结果表明，白消安降低造血干细胞，造血祖细胞比例和数目，高剂量组与低剂量组相比损伤程度更加明显。

图2 白消安对C57小鼠外周血和骨髓细胞计数的影响Fig.2 Effect of busulfan on the mouse body weight and bone marrow nucleated cells

注：(A)流式细胞仪分析时门的设置；与对照组相比，*P< 0.05。图3 白消安对造血干细胞比例的的影响Note.(A) A representative gating strategy of HSC and LT-HSC was analyzed by flow cytometry. Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.3 Busulfan decreased the percentage of bone marrow stem cells

2.4 白消安损伤小鼠造血细胞功能

为了检测白消安对C57小鼠造血系统功能的影响，分组和给药方式如上述，白消安给药后15 d，检测粒细胞巨噬细胞集落形成能力(CFU-GM)。实验结果显示，小鼠接受低剂量白消安给药后，骨髓细胞的CFU-GM集落形成数与对照组相比没有统计学差异(113.3±28.05 vs 142.5±18.64，P> 0.05)。而当小鼠接受高剂量白消安给药后，骨髓细胞的CFU-GM集落形成数较对照组下降65.42%(113.3±28.05 vs 39.17±8.89，P< 0.05)。差异均有显著性。说明40 mg/kg白消安可以诱导造血祖细增殖抑制。(见图4A)

注：与对照组相比，*P< 0.05。图4 白消安诱导C57小鼠造血干细胞和造血祖细胞增殖抑制Note.Compared with the control group，*P< 0.05.Fig.4 Busulfan induced the proliferation inhibition in HPC and HSC

单细胞集落形成能力实验结果显示，给与低剂量白消安的小鼠单细胞集落形成能力与对照组相比降低33.81%(0.62±0.13 vs 0.41±0.23，P> 0.05)；而给与高剂量组白消安的小鼠单细胞集落形成能力与对照组相比降低58.06%(0.62±0.13 vs 0.26±0.15，P< 0.05)，表明40 mg/kg白消安可以明显降低造血干细胞功能，高剂量组与对照组相比具有显著性差异。(见图4B)

为了进一步确定白消安诱导造血干细胞损伤模型，我们检测了给药15 d和给药30 d后造血祖细胞和造血干细胞的功能。实验结果显示，小鼠给予40 mg/kg白消安，30 d后外周血象和HSC和HPC的比例都有所恢复，CFU-GM的降低百分比与15 d相比有所恢复(60.71% vs 54.26%)，然而单细胞集落形成能力进一步降低(45.16% vs 73.80%)。说明随着时间的延长，白消安对骨髓造血干细胞的损伤进一步加剧。(见图5)

图5 给药后不同时间检测白消安对C57小鼠造血干细胞和祖细胞集落形成能力的影响Fig.5 Effect of busulfan on the proliferation ability of HPC and HSC at different time points

3 讨论

实验结果显示，40 mg/kg白消安可以降低外周血中白细胞数目，降低造血干细胞，造血祖细胞和长期造血干细胞的比例和数目，进一步损伤造血干、祖细胞的功能，说明白消安可以诱导C57小鼠造血系统损伤，降低造血干细胞的功能，但是小鼠体重在给药周期内未出现明显变化，给药后30 d小鼠均存活，表明该给药方案可以用于诱导造血干细胞损伤模型。

小鼠给予80 mg/kg白消安，实验周期内小鼠出现弓背，体重减轻明显或死亡。本实验中利用两个剂量白消安给药，高剂量组(40 mg/kg)比低剂量组(20 mg/kg)造血系统损伤表型更加严重，表现为外周血细胞下降更加明显，造血干细胞和祖细胞比例和数目降低，以及造血干细胞和造血祖细胞功能的损伤加剧。低剂量组(20 mg/kg)白消安给药后，小鼠的CFU-GM和单细胞集落形成能力与对照组相比，未见显著性差异，因为白消安主要损伤的是造血干细胞功能[10]，当剂量较高时也会影响造血祖细胞功能，但是造血祖细胞恢复较快。而高剂量组(40 mg/kg)白消安可以明显地抑制造血祖细胞和造血干细胞增殖能力，因而40 mg/kg的给药剂量可以满足实验需求。为了确定最佳检测时间，实验对比了高剂量组白消安给药15 d和30 d对小鼠造血损伤表型的影响。实验结果显示，给药30 d后外周血象、HSC和HPC的比例都有所恢复(结果未给出)，造血祖细胞增殖抑制有所缓解，但是造血干细胞功能进一步损伤，说明造血干细胞损伤持续存在，应用白消安有进一步诱发造血干细胞耗竭的风险。本实验采用的给药方案，试验周期内小鼠未死亡，状态良好，小鼠体重与对照组小鼠相比差异无显著性，说明40 mg/kg的给药剂量和15 d的实验周期可以成功诱导小鼠造血干细胞损伤模型的建立。

本实验利用单细胞集落形成能力体外检测HSC功能，对比以往体外检测造血干细胞功能的“鹅卵石样集落形成细胞(cobblestone area-forming cell，CAFC)”实验[11]，简便易行，时间更短。与体内移植实验有很好的相关性，可以有效地评价造血干细胞功能[8-9]。但是造血干细胞移植仍然是评价造血干细胞功能的黄金标准，本实验中采用体外单细胞集落形成实验，对评价造血干细胞功能起到很好的补充作用。在给药剂量和周期内，小鼠造血干细胞和祖细胞的比例明显降低，干细胞和祖细胞的功能受到了明显的抑制，但是对小鼠的体重和状态没有明显的改变，为后期的治疗干预提供便捷，可以有效地评价造血系统损伤，为造血干细胞损伤机制的探讨和损伤防护的研究提供模型和基础。

造血干细胞损伤是长期骨髓抑制的主要诱因[13]，而造血干细胞衰老是造血干细胞损伤的一个重要的机制[3, 14]，针对于造血干细胞衰老的研究也有许多突破性的进展[15]。Wang等[16]、Xu等[17]研究显示4 Gy或6 Gy全身照射，可以诱导造血干细胞衰老，电离辐射可以通过激活p53-p21 (Cip1/Waf1)通路诱导造血干细胞衰老，除此外，电离辐射还可以诱导造血干细胞的凋亡[18]。而白消安则主要是通过诱导氧化自由基升高和促进DNA损伤从而引起造血干细胞早老性改变(premature)，但是不引起p53-p21 Cip1/Waf1)通路的表达变化，并且对造血细胞的凋亡影响较小[19-20]。因而，白消安诱导的造血干细胞损伤模型与电离辐射诱导的造血干细胞损伤模型机制上有所差异，互为补充。但是本研究并没有进一步检测40 mg/kg白消安给药后15 d，造血干细胞衰老的相关指标，主要是因为模型建立时间为15 d，主要是通过增加细胞氧化应激和DNA损伤从而诱导造血干细胞损伤，所以本模型是否可以应用与造血干细胞衰老研究有待于进一步验证。

[1] Lu H, Zhu S, Qian L, et al. Activated expression of the chemokine Mig after chemotherapy contributes to chemotherapy-induced bone marrow suppression and lethal toxicity [J]. Blood, 2012, 119(21): 4868-4877.

[2] Mauch P, Constine L, Greenberger J, et al. Hematopoietic stem cell compartment: acute and late effects of radiation therapy and chemotherapy [J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1995, 31(5): 1319-1339.

[3] Wang Y,Schulte BA, Zhou D.Hematopoietic stem cell senescence and long-term bone marrow injury[J]. Cell Cycle, 2006,5(1): 35-38.

[4] Shao L, Luo Y, Zhou D. Hematopoietic stem cell injury induced by ionizing radiation[J]. Antioxid Redox Signal [J]. 2014, 20(9): 1447-1462.

[5] Salman B, Al-Za’abi M, Al-Huneini M, et al.Therapeutic drug monitoring-guided dosing of busulfan differs from weight-based dosing in hematopoietic stem cell transplant patients [J]. Hematol Oncol Stem Cell Ther, 2017,10(2):70-78.

[6] Peake K, Manning J, Lewis CA, et al. Busulfan as a myelosuppressive agent for generating stable high-level bone marrow chimerism in mice [J]. J Vis Exp, 2015, (98): e52553.

[7] Li C, Lu L, Zhang J, et al. Granulocyte colony-stimulating factor exacerbates hematopoietic stem cell injury after irradiation [J]. Cell Biosci, 2015, 5: 65.

[8] Chen Z, Yi W, Morita Y, et al. Wip1 deficiency impairs haematopoietic stem cell function via p53 and mTORC1 pathways [J]. Nat Commun, 2015, 6: 6808.

[9] Chen Y, Ma X, Zhang M, et al. Gadd45a regulates hematopoietic stem cell stress responses in mice [J]. Blood, 2014, 123(6): 851-862.

[10] Down JD, White-Scharf ME. White-Scharf. Reprogramming immune responses: enabling cellular therapies and regenerative medicine [J]. Stem Cells, 2003, 21(1): 21-32.

[11] Chang J, Luo Y, Wang Y, et al. Low doses of oxygen ion irradiation cause acute damage to hematopoietic cells in mice[J]. PLoS One, 2016,11(7): e0158097.

[12] 杨斌, 周玥, 王亚平. 造血干细胞衰老模型的建立及其评价 [J]. 解剖科学进展, 2009, 15(3): 315-317.

[13] Shao L, Wang Y, Chang J, et al. Hematopoietic stem cell senescence and cancer therapy-induced long-term bone marrow injury [J]. Transl Cancer Res, 2013, 2(5): 397-411.

[14] Li C, Lu L, Zhang J, et al. Granulocyte colony-stimulating factor exacerbates hematopoietic stem cell injury after irradiation [J]. Cell Biosci, 2015, 5: 65.

[15] Chang J, Wang Y, Shao L, et al.Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice [J]. Nat Med, 2016, 22(1): 78-83.

[16] Wang Y, Schulte BA, LaRue AC, et al. Total body irradiation selectively induces murine hematopoietic stem cell senescence [J]. Blood, 2006,107(1): 358-366.

[17] Xu G, Wu H, Zhang J, et al. Metformin ameliorates ionizing irradiation-induced long-term hematopoietic stem cell injury in mice [J]. Free Radic Biol Med, 2015, 87: 15-25.

[18] Meng A, Wang Y, Brown SA, et al. Ionizing radiation and busulfan inhibit murine bone marrow cell hematopoietic function via apoptosis-dependent and -independent mechanisms [J]. Exp Hematol, 2003, 31(12): 1348-1356.

[19] Probin V, Wang Y, Zhou D. Busulfan-induced senescence is dependent on ROS production upstream of the MAPK pathway [J]. Free Radic Biol Med, 2007, 42(12): 1858-1865.

[20] Meng A, Wang Y, Van Zant G, et al. Ionizing radiation and busulfan induce premature senescence in murine bone marrow hematopoietic cells [J]. Cancer Res, 2003, 63(17): 5414-5419.