大孔吸附树脂分离沙棘叶总黄酮的研究

王洪江，杨宏志，张春芝，孙天宇，王英琪

（黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆 163319）

0 引言

黄酮作为一种人体体内需要的营养成分，在体内无法自主合成，只能从日常生活的饮食当中摄入[1]。沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）是一种落叶性灌木，果实中含有较高VC，沙棘的叶中含有较高的黄酮类化合物[2]。黄酮类化合物的常用的提取方法主要有3种，分别为溶剂法、酶法和超声波辅助[3-5]，但是通过以上3种方法提取的黄酮化合物需要进一步的分离，才能制取我们需要的黄酮化合无单体。黄酮类化合物是一种合成的天然的活性物质和极性分子。大孔吸附树脂是一种物理和化学性较稳定的有机高分子化合物[6]，极适合分离纯化黄酮类物质。因此，试验利用大孔吸附树脂对超声辅助提取的沙棘叶总黄酮进行分离，研究了大孔吸附树脂的筛选、吸附和洗脱的工艺条件。

1 试验材料

芦丁标准品，购自成都邦成生物工程公司；D101树脂、XAD-7PH树脂、D3520树脂、NKA-9树脂，均购自蚌埠市天星树脂有限公司；X-5树脂、D4020树脂，均购自天津南开大学树脂厂；AB-8树脂，购自杭州争光树脂有限公司；层析柱Ф1.6×20cm，Ф2.0×30cm；SG2型pH计；高效液相色谱；BS-1E型恒温振荡培养箱；乙醇、甲醇、氯化氢、氢氧化钠、三氯化铝均为分析纯。

2 试验方法

2.1 树脂的预处理

预处理方法参照文献[7]。

2.2 分离步骤

首先提取样品；选择最适合的大孔树脂型号；进行吸附原液pH值和流速的考查；确定解析剂、洗脱剂浓度、洗脱流速和洗脱剂用量。

2.3 大孔树脂筛选

7种树脂的性能参数见表1。

2.4 吸附试验

准确称取经过预处理的7种干树脂各20mL，型号分别为1，2，3，4，5，6，7，分别加入200 mL已知浓度（C1）的样品液，在30℃、120 r/min条件下24 h。测定滤液中的黄酮浓度（C2）。树脂吸附率参照文献[8]计算。

表1 7种树脂的性能参数

2.4.1 大孔树脂洗脱率

计算解吸率参照文献[8]。

2.4.2 吸附温度对吸附量的影响

选择吸附温度分别为25，35，45，55，65℃进行试验，不同温度条件下放置恒温振荡箱中进行12 h培养，期间每1 h吸取1次上层溶液对树脂吸附液进行检测，以吸附率为检验指标。

2.4.3 吸附时间对吸附量的影响

将预处理好的样品，振荡吸附12 h，间隔1 h吸取1次上层溶液检测，以吸附率为检验指标进行计算。

2.4.4 洗脱温度对洗脱率的影响

滤出饱和吸附沙棘叶总黄酮的树脂一定量，设置振摇温度分别为25，35，45，55，65℃。洗脱结束后，吸取上层液检测，以洗脱率为检验指标进行计算。

2.4.4 洗脱时间对洗脱率的影响

滤出饱和吸附沙棘叶总黄酮的树脂10mL，振摇洗脱8 h，间隔1 h吸取1次上层溶液检测，以洗脱率为检验指标进行计算。

2.4.5 乙醇溶液的体积分数对洗脱的影响

滤出饱和吸附沙棘叶总黄酮的树脂20mL，分别加入不同体积分数为35%，45%，55%，65%，75%，85%乙醇200 mL，振荡洗脱。吸取上层洗脱液进行检测，以洗脱率为检验指标进行计算。

2.4.6 沙棘叶总黄酮的HLPC检测

沙棘叶总黄酮的检测参考易昌华等人的方法[9]。

2.4.7 沙棘叶总黄酮的纯度计算

式中：S1——沙棘叶总黄酮的质量，g；

S2——冻干后沙棘叶总黄酮的质量，g。

3 结果与分析

3.1 树脂筛选

不同型号大孔树脂的静态吸附和解析见表2。

表2 不同型号大孔树脂的静态吸附和解析

由表2可知，各树脂吸静态吸附效果最佳的为3号，其次是6，2，7号，洗脱率最佳的树脂为3号，其次是6，3号，从吸附、解析2个方面来看6，2，3号3种树脂效果都有优势。经综合对比选出最适合的树脂。

3.2 吸附温度的选择

不同吸附温度对吸附率的影响见图1。

图1 不同吸附温度对吸附率的影响

由图1可看出，随着吸附温度不断的升高，3种树脂的吸附率呈现先上升后下降的趋势，从图中也能看出，在温度在25～35℃ 3种树脂的吸附率均达到最高。由此可得，在同一温度条件下，3号树脂的吸附率明显高于其他2种。

3.3 吸附时间的选择

不同吸附时间对吸附率的影响见图2。

图2 不同吸附时间对吸附率的影响

由图2可看出，随着吸附时间的增加，吸附率呈现先增加后平缓的趋势，当吸附时间为3 h时，3种树脂的吸附率均达到最高，在同一时间下对比，3号的吸附率几乎高于其他2种。

3.4 洗脱温度的选择

不同解析温度对洗脱率的影响见图3。

图3 不同解析温度对洗脱率的影响

由图3可看出，随着洗脱温度的增加，洗脱率呈现先上升后下降的趋势，从图中也能够看出，在不同的温度下，3号树脂的洗脱率均高于6，2号2种树脂。故最优树脂为2-X-5。

3.5 洗脱时间的选择

不同解析时间对洗脱率的影响见图4。

图4 不同解析时间对洗脱率的影响

由图4可看出，随着洗脱时间的升高，3种树脂的洗脱率呈现先上升后下下降的趋势。在洗脱时间为2.5 h时，3种树脂的洗脱率均达到最高，经同一时间对比，3号树脂的洗脱率均高于其他2种树脂。

3.6 乙醇溶液的体积分数的选择

不同乙醇浓度对解析率的影响见图5。

图5 不同乙醇浓度对解析率的影响

由图5可看出，随着乙醇体积分数的升高，解析率呈现先上升直至平缓的趋势，当乙醇体积分数为65%时，3种树脂的解析率几乎达到最高。经同一乙醇体积分数对比，3号树脂的解析率均高于其他2种。

经以上因素的综合考虑，确定选择3号树脂进行后续试验，最佳条件为静态吸附条件为吸附时间3 h，吸附温度25℃，静态解析条件为解析时间2.5 h，解析温度25℃，乙醇体积分数65%。

3.7 高效液相法（HPLC）检测大孔树脂分离沙棘叶中的总黄酮量

树脂纯化的沙棘叶总黄酮HPLC图见图6。

图6 树脂纯化的沙棘叶总黄酮HPLC图

由图6可看出，为经过3号树脂纯化后沙棘叶中黄酮总量的高效液相检测图谱，根据图谱中的峰面积和公式进行计算，确定沙棘叶中的黄酮纯度为89.72%。

4 结论

选用7种树脂作为研究对象，通过比较这7种树脂对沙棘叶总黄酮的吸附效果，确定3号、6号和2号树脂吸附解析效果好。以吸附时间、吸附温度、洗脱时间、洗脱温度、乙醇体积分数为试验因素对3种树脂进行比较，可得3号树脂最优，并确定最佳条件为为静态吸附条件为吸附时间3 h，吸附温度25℃，静态解析条件为解析时间2.5 h，解析温度25℃，乙醇体积分数65%。在此条件下分离的沙棘叶黄酮经HPLC检测浓度为89.72%。

[1]郑洁.蜂胶中黄酮类化合物的富集分离研究 [D].无锡：江南大学，2007.

[2]赵玉珍.沙棘中黄酮类化合物及其药用价值 [J].沙棘，1997（1）：43-47.

[3]孙天宇，杨宏志.超声波法提取沙棘叶总黄酮最佳工艺的研究 [J].黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（3）：45-50.

[4]赵玉琪，殷丽君.沙棘叶黄酮的提取及其对抗氧化性的影响 [J].食品工业科技，2006（4）：71-72.

[5]朱红梅，赵猛，王文辉，等.酶法提取沙棘叶中黄酮的研究 [J].农业与技术，2008，28（6）：30-32.

[6]潘见，陈强，谢慧明，等.大孔树脂对葛根黄酮的吸附分离特性研究 [J].农业工程学报，1999，15（1）：236-240.

[7]Fu B，Liu J，Li H，et al.The application ofmacroporous resins in the separation of licorice flavonoids and glycyrrhizic acid[J].Journal of Cliromatography A，2005（1-2）：18-24.

[8]王晶，周禾.植物黄酮类化合物生物学功能及浸提纯化[J].中国饲料，2006（11）：24-27.

[9]易昌华，贺建华，戴球仲.中草药提取物中总黄酮含量测定 [J].湖南饲料，2004（4）：35-36.◇