肠道M细胞摄取、转运抗原机制及其临床应用研究进展

张 悦，苑梦伟，刘开阳，张 静，吕雅洁，李凌轩，刘 伟

(1河北医科大学,2河北医科大学免疫教研室,河北省重大疾病的免疫机制及干预重点实验室,河北石家庄050017)

0 引言

在1972年,Owen首次利用扫描电镜观察到人淋巴滤泡表面有一种特殊的细胞,因其表面没有致密的微绒毛,取而代之的是丰富的微褶皱,故称之为微褶皱细胞(microfold cell,M cell),也有人称之为膜性细胞(membranous cell,M cell),简称为M细胞。完全分化的M细胞的基底部细胞膜向顶部突起,细胞内凹形成特有的“袋形囊腔”［1］,呈口袋状。M细胞具有摄取、转运抗原的功能,且现阶段大多数学者认为其不具备加工提呈功能。M细胞的转运可分为三个阶段,这是一个高效、快速的过程。M细胞对微粒的捕获机制可基于其性质分为两种,在本文予以详述。针对M细胞的体内培养和原位培养的问题,学者们建立了多种体外模型辅助理解。凝集素在细胞识别和粘着反应中起重要作用,主要是促进细胞间的粘着。这一特性可以辅助M细胞对于抗原的摄取和转运。对于凝集素和M细胞之间联系的研究可以为疫苗的研究提供方向。研究表明,SIgA选择性的捆绑和吸收的机制为带有循环核苷酸序列(AAAUA)的小鼠GP2的特殊配体结合于表达在细胞表面的mGP2。而GP2可以作为位于M细胞上的细菌抗原的转录受体,参与对一些特定细菌的黏膜免疫应答,这为研发抗菌药提供新思路。

本文将详细论述M细胞与以下疾病的联系。克罗恩氏病是胃肠道炎症性疾病,病变始于含有M细胞的淋巴样滤泡相关上皮(follicle-associated epithelium,FAE)［2］。肉毒毒素与无毒成分一起组成祖毒素复合物(PTCs)。L-PTC与血凝素(hemagglutinin,HA)和GP2相互作用,通过M细胞传递到基底外侧表面,这对食源性肉毒中毒的发病起着主导作用［3］。白色念珠菌通过M细胞进入肠细胞层有两条途径［4］。M细胞运输的疯牛病病原体是人类变异型克雅氏病发病的重要因素［5］。发炎结肠中M细胞有可能被诱导产生,则M细胞有可能成为临床诊断结肠炎的表征之一［6］。

M细胞的特异机制具有为黏膜免疫系统提供药物或疫苗的潜力,疫苗接种是M细胞免疫学最成功的应用之一,M细胞靶向疫苗可以诱导有效黏膜免疫、保护病毒性心肌炎以及增强黏膜SIgA反应。相比于其他疫苗来说,口服疫苗有许多优点,在本文章中我们对其进行了介绍。

1 M细胞的顶端形态

研究表明,M细胞的表面特征主要是微绒毛缺失,这在非特异性捕获肠腔粒子中起主要作用。M细胞基底部细胞膜向顶部突起,细胞内凹形成特有的“袋形囊腔”,这一结构缩短了转运囊泡内抗原由肠腔面到基底膜表面的距离。在各种各样的实验中,David等［7］观察到独特的M细胞表型的特点是被诱导后其顶端表面有一种黏膜“捕蝇纸”,它能够捕捉任何类型的腔内颗粒。

M细胞在顶端表面表达大量的免疫监视受体,一系列分子经由这些受体将腔内抗原最终传递到黏膜下层淋巴组织［8］。因此,腔内抗原可通过识别被其利用的分子入侵M细胞［8］。例如GP2、PrPC(prion protein,细胞朊蛋白 )、C5aR(C5a receptor,C5a受体)和其他特定分子。上文提到的GP2在M细胞的顶端膜上高度表达,可以作为细菌抗原的转录受体,尤其是与大肠杆菌(Escherichia coli)和血清型伤寒杆菌(S.Typhmurium)结合［1］。GP2还与肉毒杆菌神经毒素的血凝素A1结合,增加了肉毒杆菌［9］的易感性［10］。目前已有证据表明,在M细胞顶端质膜腔侧上高度表达的PrPC可以通过增强流产布鲁氏菌(B.abortus)或其他外源性抗原的胞吞作用来促进粘膜免疫监测［11］。值得注意的是,尿素调节素在上皮细胞的M细胞中也有特异性表达并有可能作为一种微生物吸收受体,但还需要详细的研究来证实这一观点［12］。

2 M细胞摄取、转运抗原

2.1 M细胞捕获颗粒的两种机制 可溶性蛋白抗原与抗原颗粒具有形态上的区别,例如蛋白质分子和细菌之间存在差别,所以它们必须以不同的方式被捕获。M细胞可以通过两种不同的机制来捕获颗粒：基于相关配体的俘获受体的捕获与基于生物粒子的物理化学性质的捕获。

已有报道称可使用特定的“捕获受体”进行M细胞的微生物捕获,这种受体包括可以与FimH(一种细菌纤维蛋白)结合的受体GP2以及其它的重组蛋白,如重新分布的黏附蛋白beta 1整合素,免疫球蛋白A结合蛋白等［7］。虽然M细胞表面还表达了其他受体,但是并有被证实其为捕获受体。在配体介导的M细胞摄取中,因为在特定尺寸范围内的粒子发生最优吸收,所以粒子的大小和配体密度己知是影响因素。

在某些特定条件下,基于物理化学性质的捕获的效率明显高于基于配体的俘获受体的效率［7］。M细胞的转运会因暴露的抗原不同而发生改变,即M细胞的转运机制与被转运物的性质有关,如体积大小、表面pH值、表面电荷、疏水性、浓度以及是否存在M细胞特异性受体等。关于静电电荷,带正电荷的粒子与细胞的亲和力更强,在M细胞顶端的薄黏液层的滞留时间也比带负电荷或非电离的粒子更长［13］。

2.2 过程 微皱褶(M)细胞是黏膜免疫监视系统的一部分,参与启动黏膜免疫应答这一重要步骤。它可通过吸附、胞饮和吞噬等方式摄取肠腔内的抗原性异物,并以囊泡的形式将其捕获到的微粒呈递给固有层的肠道相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue,GALT)(包括淋巴细胞,巨噬细胞和树突状细胞等),继而,卵泡相关上皮(Follicle-associated epithelium,FAE)下的subepidome(SED)区域内的未成熟树突状细胞(DCs)捕获抗原。抗原启动的DCs经过成熟,迁移到GALT的T细胞区,将抗原呈递到T细胞,导致抗原特异性B细胞的激活,并最终由固有层的浆细胞产生 IgA 抗体［14］。

M细胞的跨上皮细胞转运是先通过肠腔,然后穿过上皮黏膜屏障和潜在的免疫细胞的过程,它可分为三个阶段：肠腔内抗原首先被吸附于细胞顶端膜,然后通过内吞囊泡被转运至胞内腔室,最后从基底膜经胞吐作用出胞,进行胞外运动。M细胞的细胞质层呈口袋形状,较薄,可以快速完成胞吞－胞吐过程。一个完整的胞吞胞吐作用序列最少只需10 min左右［4］,所以M细胞介导转运的机制是一个高效、快速的过程。此外,有最新的研究在对M细胞的转录组分析时发现M细胞大量表达细胞内分子,这些分子可能在通过细胞外通道［15］的过程中促进囊泡运输或肌动蛋白重塑,对于它们的功能分析为M细胞特异性抗原转运的分子机制开辟了新的研究方向［11］。

2.3 M细胞与凝集素 在M细胞摄取和转运抗原的过程中,靶向作用于M细胞表面的特定受体,可能有助于增加抗原的吸收和呈递,从而启动免疫应答反应。凝集素不止有一个能够同糖结合的位点,因此其能够参与细胞的识别和粘着,将不同的细胞联系起来。

荆豆凝集素1(Ulex Europaeus Aggulutin-1,UEA-1)可以被绑定到M细胞上,并作为M细胞的特异性标记物。但是由于凝集素是有毒的并且容易发生肠道降解,除此之外,其受体在人PP中未表达,甚至在所有小鼠的M细胞中也未表达,因此在疫苗接种中UEA-1的价值是有限的,但是稳定的无毒小分子凝集素可能具有口服疫苗靶向的潜力。在诱导抗原特异性黏膜SIgA反应中,使用UEA-1对M细胞的靶抗原进行识别是有效的,这一点已被证实。

除UEA-1外,最近还有研究发现,唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)中的成员siglecl-f也是一种新型的肠道M细胞标志物,它表达于暴露在肠腔的M细胞膜表面。当抗siglecl-f抗体注射到与M细胞结合的小鼠小肠中后,显示出通过siglecl-f靶向 M 细胞的潜力［16］。

2.4 M细胞与SIgA M细胞介导的抗原摄取有助于诱导抗原特异性分泌SIgA,因此M细胞上的摄取受体可能是有效诱导病原体特异性SIgA的粘膜免疫靶点［10］。M细胞在黏膜内可以通过诱导SIgA的分泌,在不降解内化抗原的情况下进行转化,从而在抗原特异黏膜免疫应答中发挥重要作用［17］。带有循环核苷酸序列(AAAUA)的小鼠GP-2的特殊配体结合于表达在细胞表面的MGP-2是SIgA选择性捆绑吸收的机制。Spib-b可诱导GP2,它是有效摄取腔内细菌抗原并将其传递到PPs并产生随后的肠道抗菌免疫反应的先决条件［13］。最近有报道称,M细胞表面的Dectin-1结合SIgA-抗原复合物,然后此复合物通过与DCs上的DC-SIGN相互作用被DCs转移并内化,从而诱导黏膜和全身免疫应答［18］。

3 M细胞的体外模型

在过去,对于M细胞的研究依赖于体内或原位培养的方法,如分离的组织环或外植体培养,但在人和大鼠中,M细胞仅占FAE的5%～10%。如今,为了更好的研究M细胞,学者们建立了多种M细胞的体外模型。其中沿用较广的是Des Rieux等人建立的模型——体外M细胞/FAE模型。此模型中,腺癌类肠上皮细胞系Caco-2通过与PP(peyer patch,PP)或人类淋巴细胞系共培养分化成M细胞,模仿其活性。因此,M细胞体外模型在研究病原体与肠上皮相互作用以及确定跨M细胞转位所需的分子机制方面显示出巨大的潜力。

4 M细胞与疾病

4.1 克罗恩氏病 克罗恩氏病(CD)是胃肠道炎症性疾病,好发于末端回肠和右半结肠。本病临床表现有腹痛、腹泻、肠梗阻,伴有发热、营养障碍等。病程多迁延,反复发作,不易根治。CD的微小黏膜病变称为aphtoid病变,aphtoid病变起始于含有M细胞的FAE。发生在FAE中的腔内抗原/微生物、上皮细胞和DCs之间的相互作用可能是引起CD的关键步骤。多年来,肠道通透性的增加被认为是CD的致病因素。而最近的研究表明,CD中的肠道屏障缺陷是依赖TNF-a的［2］。在炎症性肠病(IBD)的结肠炎症标本中发现CD结肠黏膜中DCs数量增加以及在CD相关黏膜炎症淋巴组织中M-DC8(+)DCs和th1型T细胞的表达,都可能有助于CD中TNF-a的产生。此外,Rickert发现70%的乳糜泻患者存在aphtoid病变［2］,而乳糜泻中常见的屏障功能障碍可能与FAE中免疫抗原相互作用引发的信号有关［19－20］。

4.2 食源性肉毒中毒 肉毒毒素是一种由肉毒杆菌产生的金属蛋白酶毒素,进入神经细胞后,它将抑制神经递质释放并导致麻痹。肉毒毒素与一种或多种无毒成分一起组成祖毒素复合物(progenitor toxin complexes,PTCs),L-PTC与HA和GP2相互作用,突破了M细胞的肠上皮屏障,最终导致食源性肉毒中毒的发生。与肠腔环境中的肉毒毒素有关的nap(NTNHA/HA的复合体)在穿过肠上皮细胞后会分离,L-PTC的所有成分都通过M细胞传递到基底外侧表面,并被CD11c DCs捕获。HA与GP2的交互以及L-PTC与M细胞的定位都需要对所有HA亚组分进行集成即依赖于完整的HA复合体。这些发现为开发新型的抗毒素疗法和口腔生物制剂系统提供了基础［6］。

4.3 白色念珠菌感染 白色念珠菌粘附在上皮细胞上随后发生内化,这是浅表性和侵袭性念珠菌病致病过程中的的一个关键步骤。这一内化过程是由M细胞经肌动蛋白介导的内吞机制通过识别菌丝主导的,此后,白色念珠菌侵入共培养物(与Raji B细胞系的B淋巴细胞共同培养的Caco-2细胞称为共培养,可获得M细胞),并在M细胞中进行有效传递。除内吞作用外,白色念珠菌也能够在与M细胞相互作用的早期阶段利用菌毛通过主动穿透侵入M细胞。由此可见,通过M细胞,白色念珠菌能够用两条途径侵入肠细胞层［21］。

4.4 人类变异型克雅氏病 人类克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease,CJD)是传染性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathy,TSE),属于致命的神经退行性疾病。研究表明人类变异型克雅氏病(Variant creutzfeldt-jakob disease,vCJD)与疯牛病(即牛的TSE)有关,vCJD是人类食用了受到疯牛病病毒污染的食品之后引起的。PrPSc作为疯牛病的病原体,经口腔传播时,通过肠道上皮细胞后经M细胞迅速整合入派尔集合淋巴结的FAE中,表明M细胞参与了在人体中运输疯牛病的病原体的过程。此外存在于M细胞的囊泡中的醛缩酶A作为PrP结合蛋白可与PrPSc结合,且M细胞分化的牛肠上皮细胞系能够在我们的体外模型中转染PrPSc。这些都表明了M细胞在人类变异型克雅氏病的致病过程中发挥了关键作用［9］。

4.5 炎症性肠病 在肠道炎症方面,经研究发现慢性肠道炎症产生的炎性细胞因子可诱生PP型M细胞［6］。证据在于肠道炎症,如炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),会产生炎症性细胞因子,而目前的研究表明任意表型子集的M细胞的发育和功能都与炎性细胞因子的局部产生密切相关［6］,例如在研究结肠炎的右旋糖酐钠和柠檬酸杆菌模型的过程中,结肠上皮炎症最严重时都能诱导出大量的PP表型M细胞［6］。若将这一观点加以有效利用,则被诱生的M细胞可能在感染或自身免疫失调方面为结肠炎症提供临床诊断。

5 M细胞的应用与发展

病原体可以利用M细胞作为感染入口,同样,利用M细胞特异的机制可以为黏膜免疫系统提供药物或疫苗,而疫苗接种是M细胞免疫学最成功的应用之一［4］。

5.1 M细胞靶向性疫苗 在这里我们介绍三种M细胞靶向性疫苗。目前制成了一种有效的抗GP2-sa黏膜疫苗,抗GP2-sa可以有效诱导黏膜SIgA反应,以抗GP2-sa为基础的M细胞靶向疫苗是诱导有效黏膜免疫的一种新策略［22］；M细胞靶向性疫苗CS-FimH-pvP1经口服免疫小鼠后,对柯萨奇病毒诱导的病毒性心肌炎具有保护作用［4］,这将对人类病毒性心肌炎治疗的研究提供很大帮助；在动物模型中由Claudin-4特异性靶向肽介导的M细胞靶向增强黏膜SIgA反应强于对非靶向黏膜抗原的反应,这有希望应用于黏膜疫苗接种［8］。

5.2 口服疫苗 许多M细胞靶向分子已被用于黏膜疫苗的开发［2］,经口服的疫苗具有许多优势：降低传统注射方式感染病菌的可能性并减少人的疼痛感［4］；使用口服黏膜疫苗建立保护性免疫可以避免一些最初的病原体感染；能够促进聚集于肠道的M细胞对抗原的吸收以建立肠道的局部免疫从而有效抵抗肠道病原体的入侵。现在口服疫苗已成功应用于动物,现在研制了一种以M细胞和树突状细胞为靶向,传递猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)尖刺蛋白核心中和表位(centrotein core neutralization epitope,COE)的抗PEDV感染的口服重组干酪乳杆菌疫苗［23］。因此未来我们可以把开发针对M细胞的口服疫苗作为疾病预防的重点之一。

6 结语

综上所述,M细胞转运抗原是启动黏膜免疫应答最重要的第一步。而近年来,随着对M细胞摄取和转运抗原的深入研究,M细胞的临床医学价值渐渐显现出来。M细胞与多种疾病的发生密切相关,例如文中已列举的克罗恩氏病,食源性肉毒中毒和白色念珠菌感染。虽然部分疾病已通过针对M细胞的药物或疫苗得到治疗,但目前可用的M细胞靶向疫苗不主动向M细胞定向抗原,因此就需要我们进一步了解M细胞的机制以搜索特定的M细胞分子开发M细胞靶向策略,为疫苗的进一步研究提供帮助。