人p65真核表达载体的构建及鉴定

杨莞琦，王瑞峰，程龙，牛畅

1.首都师范大学 生命科学学院，北京 100048；2.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100850

作为抗感染免疫的关键通路，NF-κB信号通路能够被多种信号，包括多种病原的组分如脂多糖，前炎性细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素 1（IL-1）及丝裂原等活化[1]。NF-κB家族包括 5个成员，即 RelA（p65）、RelB、c-Rel、NF-κB1（p105-p50）和 NF-κB2（p100-p52），它们的 N端均包含一个Rel同源结构域（RHD），这一大约包含300个氨基酸残基的同源序列能够介导其与DNA结合及二聚化[2]。在正常细胞中，NF-κB/Rel与IκBa、IκBb或 IκBg结合，以非活性形式被阻滞在胞质中。当IκB激酶（IKK）复合物活化时，磷酸化IκB家族成员，使其泛素化并被蛋白酶体降解[3-4]。IκB 降解后 NF-κB/Rel被释放，进一步由翻译后修饰（磷酸化、乙酰化、糖基化）作用激活，并转移到细胞核内，在核内单独或联合其他转录因子（AP-1、Ets和Stat）共同诱导下游基因（如IL-6、TNFα、IL-12等）转录，这些下游分子发挥不同的生物学功能，包括先天和适应性免疫、炎症、应激反应、B细胞发育和淋巴器官形成[5-6]。在真核细胞中，NF-κB主要以p50-RelA（p65）异源二聚体的形式存在[7]。已有报道，NF-κB发挥功能需要与其他蛋白的相互作用[8]。为了寻找到更多的NF-κB相互作用蛋白，我们构建了pcDNA3.1-Myc-p65真核表达载体，并对该载体的定位和活性进行了验证，为进一步筛选NF-κB的相互作用蛋白及功能研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T细胞、HeLa细胞、真核表达载体pcDNA3.1-Myc由本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞和LipofectAMINE 2000转染试剂购自Invitrogen公司；PCR试剂、限制性内切酶、T4DNA连接酶及DL2000 DNA marker购自TaKaRa公司；DNA纯化、质粒提取、萤光素酶活性检测试剂盒购自Promega公司；Vigofect转染试剂和Western印迹发光底物试剂盒购自威格拉斯生物技术（北京）有限公司；DMEM培养基和胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；DAPI染料购自Sigma公司；Myc抗体、GAPDH抗体、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司。

1.2 pcDNA3.1-Myc-p65真核表达载体的构建

根据pcDNA3.1-Myc载体图提供的酶切位点，分别在上、下游引物中加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。根据文献报道[9]的p65编码序列设计上游 引 物（5′-GAATTCTGGCTCGTCTGTAGTGCACG C-3′）和下游引物（5′-GGATCCGGAGCTGATCTG ACTCAGCAG-3′），引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成。利用PCR技术，以乳腺癌文库为模板扩增p65基因的编码序列［两步法PCR扩增条件：98℃预变性1 min，30个循环反应（98℃ 10 s，68℃ 2 min），4℃保存］。琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物大小正确后用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后将分别经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切形成粘性末端的PCR片段和pcDNA3.1-Myc空载体，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养12 h后挑取LB平板上单个可见菌斑进行菌液PCR鉴定。琼脂糖凝胶电泳显示为阳性的克隆接种于液体LB培养基，37℃培养12 h并提取质粒，所得质粒再经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定结果正确的阳性克隆送样品测序，序列测定由北京博迈德科技发展有限公司完成。

1.3 Westrn印迹检测转染基因的表达

将含10%胎牛血清的DMEM培养基培养的HEK293T细胞接种于六孔板，待细胞密度达60%～80%时，按照VigoFect转染试剂说明书转染对照空载体和重组质粒，48 h后观察转染效率并收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液裂解收集到的细胞，蛋白定量后取20 μg蛋白样品进行SDS-PAGE并转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉常温下封闭1 h，分别与按一定比例稀释的抗Myc抗体和抗GAPDH抗体室温孵育2 h或4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后与HRP标记的羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗孵育1 h，TBST漂洗3次后加入发光底物孵育5 min，在暗室中用X线胶片曝光显影。

1.4 免疫荧光

将宫颈癌HeLa细胞接种于放置了圆形玻片的24孔板中，细胞密度达40%～50%时，用LipofectAMINE 2000转染对照空载体和重组质粒，24 h后加入浓度为10 ng/mL的TNFα刺激5 h，弃去细胞培养液，PBS清洗圆形玻片后用3%甲醛（PBS配制）室温固定20 min，PBS洗去甲醛后加入裂解液（0.5%Triton X-100+1%羊血清）置于冰上通透 10 min，用 1%NGS（PBS配制）封闭 30 min，Myc抗体4℃孵育过夜，用1%NGS洗3次后加入荧光素标记的二抗αm448室温孵育2 h，用PBS洗3次后加入DAPI染核5 min，PBS清洗后滴加3～5 μL防淬灭剂封片，荧光显微镜下观察、拍照，4℃暗盒内避光保存。

1.5 萤光素酶活性检测

HEK293T细胞接种于24孔细胞培养板中，待细胞密度达60%～80%时，将重组质粒和NF-κBLuc萤光素酶报告基因质粒按所需比例和用量转染HEK293T细胞，同时每孔均共转染海肾萤光素酶对照报告基因质粒pRL-TK消除转染效率的误差。转染24 h后，加入浓度为10 ng/mL的TNFα刺激5 h，收集细胞加入细胞裂解液，取30 μL裂解上清液加入等体积的萤光素酶检测试剂，用化学发光检测仪检测萤光素酶活性；继续加入30 μL终止液，淬灭反应同时启动海肾萤光素酶反应，测定海肾萤光素酶活性。每组实验均进行3次重复，取平均值做图。

2 结果

2.1 真核表达载体的构建和鉴定

PCR扩增p65基因片段，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后在约1600 bp处可见明显的扩增条带，与扩增片段大小基本一致。用DNA回收试剂盒回收，将PCR产物与pcDNA3.1-Myc载体同时用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物连接后转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆扩增p65基因片段，能够扩增出p65基因的克隆为阳性克隆，培养后提取质粒进一步双酶切鉴定，能够切出p65基因片段的克隆确定为阳性克隆，如图1酶切后得到2条带，约1600 bp的条带是目的条带，约5000 bp的条带是空载体条带。将阳性克隆测序，证实pcDNA3.1-Myc-p65重组质粒插入片段的序列与已报道的p65序列完全一致，表明p65的真核表达载体构建成功。

2.2 Western印迹鉴定pcDNA3.1-Myc-p65的表达

将构建的pcDNA3.1-Myc-p65重组质粒、对照空载体pcDNA3.1-Myc（阴性对照）、pcDNA3.1-Myc-p53（阳性对照）分别瞬时转染HEK293T细胞，48 h收集细胞并用RIPA裂解，提取细胞总蛋白，抗Myc抗体Western印迹检测pcDNA3.1-Mycp65蛋白的表达。从图2可见，转染pcDNA3.1-Myc空载体的细胞没有条带，转染pcDNA3.1-Myc-P53质粒的细胞在相对分子质量53 000处有条带，转染pcDNA3.1-Myc-p65质粒的细胞在65 000处有特异条带，说明构建的pcDNA3.1-Myc-p65重组质粒在蛋白水平得到表达。

2.3 pcDNA3.1-Myc-p65免疫荧光定位

转染了pcDNA3.1-Myc-p65重组质粒的宫颈癌HeLa细胞，经固定、封闭、裂解后用Myc和αm488抗体孵育，DAPI核染色后封片，在荧光显微镜下观察拍照。由图3可知，没有TNFα刺激时，p65主要分布在细胞质中，胞质中的IκB与p65结合抑制了其活性，图中蓝色为DAPI标记的细胞核；加入TNFα后，大部分p65进入细胞核，因为TNFα激活了IKK复合物，该复合物能够磷酸化IκB家族成员，使其泛素化并被蛋白酶体降解，IκB降解后p65被释放，进一步由翻译后修饰（磷酸化、乙酰化、糖基化）作用激活，并转移到细胞核内，激活下游基因的转录。

2.4 pcDNA3.1-Myc-p65萤光素酶报告基因活性检测

图1 pcDNA3.1-Myc-p65载体的酶切鉴定

图2 pcDNA3.1-Myc-p65载体的蛋白表达鉴定

pcDNA3.1-Myc-p65重组质粒和NF-κB-luc报告基因共转染HEK293T细胞，24 h后加入10 ng/mL的TNFα刺激5 h，收集细胞，检测萤光素酶活性。结果如图4，p65和TNFα均可以明显激活NF-κB的转录，并且p65是以TNFα不依赖的方式激活NF-κB信号通路活性。

3 讨论

病原相关分子模式（pathogen-associated mo⁃lecular patterns，PAMP）如脂多糖等，炎性细胞因子如TNF、IL-1及丝裂原等信号结合细胞膜上的受体，通过一系列的分子传递，最终激活NF-κB信号通路的转录因子，其中p65被认为是最重要的转录因子。p65发挥功能需要结合一些蛋白，这些蛋白有的促进p65转录活性的发挥，被称为共激活因子，如 p300[10]、AEG-1[11]等；有的抑制 p65的转录活性，被称为共抑制因子，如RAC3[12]、周期蛋白D1[13]、ING4[14]等。为了寻找更多的共调节因子，我们构建了p65的真核表达载体pcDNA3.1-Myc-p65，酶切鉴定和蛋白表达鉴定均提示载体构建成功。

接下来将pcDNA3.1-Myc-p65转染细胞，对其转录翻译出来的Myc-p65蛋白进行了初步验证。首先通过免疫荧光检测其定位，发现Myc-p65蛋白主要定位于细胞质中，在加入TNFα后主要定位于细胞核内。TNFα能激活IKK复合物，活化后的IKK复合物又可以磷酸化NF-κB的抑制分子IκB,磷酸化的IκB蛋白被泛素连接酶复合物SCFβTrCP泛素化，并最终被蛋白酶体降解[4]。这样，原本被结合并滞留在细胞质中的转录因子（p65、c-Rel、RelB、p50、p52等)可以进入细胞核，开启下游基因的转录。上述结果证实构建的Myc-p65的定位与文献报道一致。其次，我们检测了Myc-p65对NF-κB报告基因活性的调节，发现Myc-p65能促进报告基因的活性，且这种促进作用不依赖于TNFα，这与p65的已知功能一致。上述结果均提示Myc-p65能够发挥内源p65相同的功能，可以用于后续相互作用蛋白的筛选。

图3 pcDNA3.1-Myc-p65在宫颈癌HeLa细胞中的定位

图4 pcDNA3.1-Myc-p65激活NF-κB的转录活性

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