Wnt信号通路在结直肠侧向发育型肿瘤中的研究进展

范久亿 李 军 丁士刚

北京大学第三医院消化内科(100191)

1982年命名为int-1的原癌基因在小鼠腺瘤病毒整合部位被发现，之后研究进一步发现了int-1与果蝇无翅基因wingless为同源基因，两者合称为Wnt[1]。Wnt信号通路是一条进化上高度保守的信号通路，由Wnt配体、跨膜受体、调节因子、胞质信号转导蛋白和核内转录因子等共同构成，参与调控细胞的生长、分化、迁移、凋亡等生理过程，其异常激活与肿瘤的发生密切相关[2]。Wnt信号通路在消化道肿瘤，尤其是结直肠癌的发生、发展中发挥重要作用。研究[3]表明80%的散发性结直肠癌患者可发生Wnt信号通路核心基因APC突变。结直肠侧向发育型肿瘤(laterally spreading tumor,LST)是一种有较高恶变潜能的肿瘤，Wnt信号通路的激活在LST的发生、发展中发挥重要作用。本文就Wnt信号通路在结直肠LST中的研究进展作一综述。

一、 Wnt信号通路的组成

Wnt信号通路主要由Wnt家族分泌蛋白(Wnt)、跨膜受体卷曲蛋白(frizzled,Frz)以及低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low density lipoprotein receptor-related protein 5/6,LRP5/6)、β-连环蛋白(β-catenin)、蓬乱蛋白(dishevelled,Dvl)、腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)蛋白、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、酪蛋白激酶Iα(casein kinase Iα,CKIα)、轴蛋白(axin)、T细胞转录因子/淋巴样增强因子(T cell factor/lymphoid enhancing factor,TCF/LEF)等组成，包括经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路[4]。

1.经典Wnt信号转导通路：Wnt/β-catenin转导通路是经典的Wnt信号通路。在非激活状态下，APC、GSK-3β、CKIα和axin形成降解复合物，使β-catenin磷酸化后被泛素-蛋白酶体系统降解。激活状态下，Wnt配体与细胞膜表面的跨膜受体Frz和LRP5/6结合形成三聚体，使细胞质内的Dvl活化，降低由APC、GSK-3β、CKIα和axin形成的降解复合物的稳定性，阻止β-catenin磷酸化后被泛素-蛋白酶体系统降解。β-catenin因在细胞质内浓度升高而转入细胞核内与转录因子TCF/LEF相互作用，进而激活Wnt信号通路，活化下游靶基因表达，如myc、cyclin D1、TCF-1、MMP-7、AXIN2、BIRC5等[5-6]。TCF/LEF转录因子家族由LEF-1、TCF-1、TCF-3以及TCF-4组成，其中TCF-4在结直肠癌细胞中显著表达，与结直肠肿瘤的发生密切相关[6]。

2.非经典Wnt信号转导通路：在非经典Wnt信号转导通路中，Wnt配体仅与Frz结合，而无需LRP5/6的作用，此通路包括Wnt/Ca2+信号通路和Wnt/平面细胞极性(planar cell polarity,PCP)通路。Wnt/Ca2+通路由Wn5a和Wnt11结合Frz，通过G蛋白介导促进细胞内Ca2+释放，进而激活钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,Camk Ⅱ)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和钙调磷酸酶。Camk Ⅱ和PKC的激活对经典Wnt信号通路产生抑制作用，而钙调磷酸酶的激活则可激活活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)，从而活化靶基因，调节细胞间黏附性。Wnt/PCP通路可激活Dvl蛋白的DEP结构域，活化Rac、GTP酶、RhoA等，进而激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)，活化的JNK转移至核内，调控下游基因表达，从而调节细胞极性和细胞间黏附性[7]。

二、Wnt信号通路的调节

Wnt信号通路除受β-catenin、Dvl、APC、GSK-3β、axin等成员的活化状态影响外，亦可被许多其他分子和基因调控。如Wnt抑制因子-1(Wnt inhibitory factor-1,WIF-1)、分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled related proteins,SFRPs)、Dickkopf蛋白(Dkk)、抗衰老基因Klotho等可抑制Wnt信号通路，R-spondin蛋白(Rspo)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、NOTCH1等则可激活Wnt信号通路。WIF-1由1个N端区域、5个表皮生长因子样重复区域和1个高亲水性羧基端组成，可直接与Wnt蛋白结合而阻断Wnt信号通路[8]。SFRPs与Frz受体具有部分相似的半胱氨酸富集区域序列，通过与Frz结合而抑制Wnt信号通路。SFRPs包含5个家族成员即SFRP1～5。最新研究发现，仅SFRP1在肿瘤细胞中表达缺失，SFRP2～4起源于肿瘤基质，有促进肿瘤发生倾向[9]。Dkk1作为Wnt信号通路抑制剂，可与Wnt竞争性结合LRP5/6，从而抑制Wnt信号通路活性。研究[10]显示Dkk1在有骨转移的乳腺癌细胞中过度表达，提示应用抗Dkk1抗体可作为靶向治疗的新策略。Klotho是一种抗衰老基因，其表达产物Klotho蛋白可抑制Wnt蛋白表达，阻止Wnt蛋白进入细胞核激活下游基因，从而抑制 Wnt信号通路[11]。Rspo是分泌性蛋白家族，其furin-like结构域被认为是激活Wnt/β-catenin通路的关键部位[12]。COX-2在结直肠癌中过表达，其通过激活Wnt/β-catenin通路促进肿瘤的生长[13]。Ishiguro等[14]的研究发现，在结肠癌细胞中NOTCH1可诱导β-catenin向细胞核内迁移，激活Wnt信号通路。

三、Wnt信号通路与结直肠LST

结直肠腺瘤主要分为LST和隆起型腺瘤(protruded-type adenoma,PA)。LST是一类起源于结直肠黏膜、侧向扩展生长的浅表型病变，直径在10 mm以上，此类病变极少向肠壁垂直侵犯[15-16]。LST根据其在内镜下的不同表现分为颗粒型(laterally spreading tumor granular type,LST-G)和非颗粒型(laterally spreading tumor non-granular type,LST-NG)，前者又分为颗粒均一型和结节混合型，后者又分为扁平隆起型和假凹陷型[17]。LST因其具有较高恶变潜能而备受研究者关注。

1.Wnt信号通路成员与结直肠LST的关系：作为Wnt信号通路成员，Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC等与LST之间存在紧密联系。Shi等[18]研究了20例PA、20例LST和20例结直肠癌患者的Wnt/β-catenin/c-myc mRNA和蛋白表达水平，结果发现结直肠癌组织中Wnt/β-catenin/c-myc mRNA和蛋白表达均高于LST组，而LST组高于PA 组，提示Wnt/β-catenin/c-myc信号通路的激活与LST的发生和恶变存在密切联系。Wang等[19]对50例LST和54例PA患者的β-catenin、磷酸化GSK-3β、cyclin D1、c-myc的表达进行研究，结果发现β-catenin、磷酸化GSK-3β、cyclin D1以及c-myc在LST组中的表达水平明显高于PA组，且不受患者年龄影响。此外该研究亦发现，LST中高级别上皮内瘤变组β-catenin、磷酸化GSK-3β表达高于低级别上皮内瘤变组，而PA组中无此差异，提示LST中Wnt信号通路的激活程度强于PA，LST较PA具有更高的恶变潜能。

2.Wnt信号通路调节因子与结直肠LST的关系：Wnt信号通路的抑制因子SFRPs与LST的关系愈发引起学界关注。翟国栋等[20]对SFRP1、SFRP2、SFRP5在52例LST和51例PA中的表达状态和甲基化水平进行研究，发现LST患者的SFRP1基因存在高甲基化，SFRP1 mRNA和蛋白表达水平显著降低，SFRP2、SFRP5基因不存在甲基化，其mRNA和蛋白表达水平与PA无明显差异。Sugai等[21]的研究发现，38例LST-G和35例LST-NG中SFRP1基因甲基化的发生率分别为68.4%、48.6%，两者间差异无统计学意义。SFRP1基因甲基化可导致Wnt信号通路抑制因子SFRP1表达降低，进而激活Wnt信号通路，可能为LST的发生、发展因素。

3.Wnt信号通路下游基因与结直肠LST的关系：孙颖等[22]的研究发现MMP-7 mRNA和蛋白在LST中的表达显著高于PA 组，正常黏膜中则未见MMP-7表达。周峻锋等[23]研究了55例LST、20例PA和10例炎症性息肉(inflammatory polyp,IP)患者的TCF-4、MMP-7蛋白表达，发现TCF-4、MMP-7 在LST 组的表达水平显著高于PA 组和IP 组，LST中TCF-4与MMP-7的表达呈正相关。MMP-7是金属基质蛋白酶家族中的重要成员，可降解基底膜和细胞外基质，增强细胞的侵袭性，对肿瘤转移发挥重要作用。

Shi等[18]发现结直肠LST组c-myc表达显著高于PA组，差异有统计学意义(P<0.05)。c-myc基因对调节细胞增殖具有重要作用，其表达产物c-myc蛋白是细胞分裂周期G1期的进展因子[24]。此外，c-myc亦可促进血管内皮生长因子的表达，促进肿瘤组织中的血管生长[25]。

4.Wnt信号通路与结直肠LST分型：COX-2作为Wnt信号通路的激活因子，其在LST中的表达水平显著高于PA[26]。Mukawa等[27]的研究发现，COX-2在PA、LST-G以及LST-NG中的表达率分别为73.1%、88.2%、31.6%，LST-G中COX-2表达显著高于LST-NG。段天英等[28]对55例LST和20例PA进行研究，发现β-catenin在LST结节混合型和LST-NG中的表达高于PA，颗粒均一型与PA间的表达则无明显差异，提示LST结节混合型和LST-NG或许存在独特的分子生物学机制，LST颗粒均一型的发生可能类似于PA。吴杰等[29]研究了β-catenin、磷酸化GSK-3β、桩蛋白、整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)在LST的4种不同内镜分型中的表达，发现即便同属于LST-NG，β-catenin、磷酸化GSK-3β、桩蛋白在假凹陷型中的表达较扁平隆起型均显著升高，提示LST假凹陷型可能具有特殊的发生机制。Sakai等[30]对LST-G和LST-NG基因突变的情况进行研究，发现APC基因突变率在两种形态中分别为88%和82%，差异无统计学意义，且APC基因突变率在LST的两种病理类型—腺瘤和癌中无明显差异，提示APC基因突变与LST的早期发展相关。

四、总结

结直肠LST作为具有较高恶变潜能的肿瘤，其发生、发展机制以及靶向治疗的研究对结直肠癌预防具有重要作用。Wnt信号通路除参与调控细胞的生长、分化、迁移、凋亡等生理过程，其异常激活与LST的发生有紧密联系。目前关于Wnt信号通路在结直肠LST中的研究尚存在一些问题：研究纳入病例数较少，其中发生率偏低的假凹陷型的例数则更少，导致研究结果可能存在偏倚；前述部分研究提出LST的不同分型间可能存在独特的分子生物学机制，但未完全阐明等。由于Wnt信号通路是一个复杂的信号转导系统，与LST之间的关系仍存在许多问题需进一步研究，而针对Wnt信号通路中导致LST发生的关键因子研制靶向抗肿瘤药物则是一项巨大而富有意义的挑战。