粪菌移植对DSS诱导的结肠炎小鼠内脏敏感性的影响*

陈 立 王承党

福建医科大学附属第一医院消化内科 消化系病研究室(350005)

背景：粪菌移植(FMT)能减轻炎症性肠病(IBD)患者肠黏膜炎症、改善临床症状，但具体作用机制尚未明确。目的：探讨FMT对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠内脏敏感性的影响。方法：小鼠饮用2.0% DSS溶液制备结肠炎模型。将40只C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(A组)、模型对照组(B组)、双歧杆菌三联活菌组(C组)、粪便滤液组(D组)，分别给予0.9% NaCl溶液、0.9% NaCl溶液、双歧杆菌三联活菌液、粪便滤液灌肠。计算小鼠疾病活动指数(DAI)、结肠组织病理学评分；测定不同结直肠扩张(CRD)容积时腹壁肌电幅值变化；免疫组化法测定腰骶髓P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)表达。结果：B组小鼠DAI、结肠组织病理学评分和腰骶髓SP表达明显高于A组、C组和D组(P<0.05)；而A、C、D三组相比差异无统计学意义(P>0.05)。扩张容积为0.04、0.06、0.08 mL时，B组腹壁肌电幅值显著高于A组、C组和D组(P<0.05)，且与SP表达之间存在正相关关系(P<0.05)。四组小鼠腰骶髓CGRP表达相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论：FMT可改善结肠炎小鼠的内脏敏感性、减少腰骶髓SP表达，其降低内脏敏感性的作用可能与抑制脊髓背角SP表达有关。

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)常表现为反复腹痛、腹泻、黏液脓血便等，部分缓解期IBD患者也常出现腹痛、排便异常等肠易激综合征(IBS)样症状[1]，内脏高敏感被认为是IBD和IBS患者相关疼痛症状的主要病理生理机制[2-3]。处于缓解期甚至黏膜已愈合的IBD患者出现IBS样症状是提示还存在炎症活动还是合并IBS，这一问题目前仍不明确。临床上需一种治疗措施既可拮抗肠道炎症又能减轻处于疾病活动期或缓解期患者的临床症状(无论是由炎症活动还是合并功能性疾病引起)。粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)是一种将健康人的粪便以混悬液方式通过一定途径输入至患病个体肠道内以恢复或补充正常肠道菌群，从而实现疾病治疗目的的治疗手段[4]。FMT可用于治疗IBD，但具体作用机制仍处于研究探讨中。本研究通过葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)建立小鼠结肠炎模型并给予粪便滤液灌肠治疗，旨在探讨FMT对内脏敏感性的影响及其可能机制，从而为IBD的临床诊治提供一定的依据。

材料与方法

一、实验材料

1.实验动物：雄性清洁级健康C57BL/6小鼠50只，体质量18～22 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司。用混合配方饲料(由上海斯莱克实验动物中心提供)喂养，自由进食饮水，每日更换饮水、饲料，定期更换垫料，保持小鼠生活环境通风和清洁卫生。

2.主要试剂与器材：DSS购自MP Biomedicals Inc,；双歧杆菌三联活菌胶囊购自上海信谊药厂有限公司；尿粪隐血试验试剂购自南京建成生物工程研究所；浓缩型兔抗小鼠P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，工作浓度分别为1∶100、1∶50；免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。多道生理信号采集系统(RM6240BD，成都仪器厂)；数字显微摄像系统(Olympus公司)。

二、实验方法

1.小鼠粪便滤液的制备：参照Cui等[5]的研究方法制作粪便滤液。

2.实验动物分组和处理：随机选取10只小鼠作为粪便供体组，余40只小鼠按1∶3的比例随机分成正常对照组(A组，n=10)和模型组(n=30)。模型组小鼠参照Chassaing等[6]的方法自由饮用 2.0% DSS(w/w,20g/L)蒸馏水溶液7 d，诱导急性结肠炎，然后改饮用蒸馏水；A组小鼠自由饮用蒸馏水。实验第8天，将模型组随机分为模型对照组(B组)、双歧杆菌三联活菌胶囊组(C组)、粪便滤液组(D组)，每组各10只。实验第11天，A、B组小鼠给予0.9% NaCl溶液灌肠(1.0 mL)，C组给予双歧杆菌三联活菌液灌肠(1.0 mL,0.255 g/kg)[7]，D组给予粪便滤液灌肠(1.0 mL,15.197 g/kg)[8]，2次/d，0.5 mL/次，间隔1 d，总共6次。灌肠治疗结束2 d后，参照La等[9]和刘玮等[10]的方法行结直肠扩张(CRD)，扩张容积为0.02、0.04、0.06、0.08 mL时测定小鼠腹外斜肌肌电。

3.疾病活动指数(DAI)[11]：每天观察并记录小鼠进食、饮水、精神、活动、排便等情况，称重体质量，计算DAI评分。

4.结肠组织病理学评分：CRD实验结束后，用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉小鼠，剖腹取病变明显的远端结肠，行病理学检查并进行评分。正常肠黏膜，0分；黏膜层轻度炎症和水肿，基底部1/3隐窝消失，1分；黏膜层中度炎症，基底部2/3隐窝消失，2分；黏膜层中度炎症，隐窝完全消失，但上皮层尚完整，3分；黏膜层、黏膜下层、肌层中度炎症，隐窝和上皮层消失，4分[12]。每张切片随机选取3个高倍视野，组织病理学评分取均值。

5.腰骶髓免疫组化染色：取腰膨大以下L6-S1脊髓节段，经甲醛固定、石蜡包埋，连续4 μm厚切片。采用免疫组化SP法检测SP和CGRP表达，具体步骤参照试剂盒说明书操作。每张切片随机选取3个高倍视野，采用IPP 6.0图像分析系统进行计算，取均值。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况和DAI评分

A组小鼠在整个实验中毛色光整，反应灵活，活动、进食、排便均正常，体质量增加。模型组小鼠饮用2.0% DSS溶液后逐渐出现毛色不光整，反应迟钝，活动、进食减少，粪便呈糊状，且次数增多，粪便隐血试验阳性，第5天开始出现不同程度的体质量下降，停用DSS后体质量仍继续下降；实验第10天，即灌肠前1天C组和D组各有1只小鼠死亡，解剖发现结肠明显充血、水肿、溃疡。造模后，B组、C组、D组之间DAI相比差异无统计学意义(P>0.05)。灌肠后，A组、C组、D组DAI均显著均低于B组(P<0.05)，而这三组之间无明显差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组小鼠DAI和结肠组织病理学评分比较

*与B组比较，P<0.05

二、结肠组织病理学评分

DSS诱导的小鼠结肠炎组织学表现为肠黏膜上皮细胞间断坏死脱落，大量炎症细胞浸润，多为中性粒细胞、淋巴细胞，间质有轻微水肿，腺体排列基本规则；给予灌肠后，C组和D组肠组织损伤减轻(图1)。A组、C组、D组组织病理学评分均显著低于B组(P<0.05)，而这三组之间无明显差异(P>0.05)(表1)。

三、小鼠腹壁肌电变化

各组小鼠腹壁肌电幅值随着扩张容积的升高而增高。CRD容积为0.02 mL时，四组小鼠腹壁肌电幅值无明显差异(F=0.814，P=0.500)。CRD容积为0.04、0.06、0.08 mL时，B组腹壁肌电幅值显著高于A组、C组、D组(P<0.05)，而后三组之间扩张容积为0.04、0.06 mL的腹壁肌电幅值相比差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

四、小鼠腰骶段脊髓背角SP、CGRP表达

1.脊髓背角SP表达：SP阳性神经元集中分布于脊髓背角浅层，呈细胞质内褐色颗粒或细丝状，对称分布。A组、C组和D组SP表达均显著低于B组(P=0.000，P=0.010，P=0.035)，而这三组之间无明显差异(P>0.05)(图2、表3)。

2.脊髓背角CGRP表达：CGRP阳性神经元表达于脊髓背角，呈细胞质内棕黄色颗粒。四组小鼠CGRP表达无明显差异(F=1.530，P=0.225)(图3、表3)。

五、脊髓背角SP、CGRP表达水平与腹壁肌电幅值的相关性分析

图1 各组小鼠结肠组织病理学结果(HE染色，×200)

表2 不同扩张容积时各组小鼠腹壁肌电幅值比较

与B组比较，*P<0.05，**P<0.01；#与A组比较，P<0.05

图3 各组小鼠脊髓背角CGRP表达情况(免疫组化染色，×400)

表3 各组脊髓背角SP、CGRP表达

*与B组比较，P<0.05

CRD扩张容积为0.04、0.06、0.08 mL时，脊髓背角SP表达与腹壁肌电幅值之间呈正相关关系(r=0.467，P=0.016；r=0.517，P=0.007；r=0.588，P=0.002)；扩张容积为0.02 mL时，两者之间无明显相关性(r=0.200，P=0.327)。

CRD扩张容积为0.02、0.04、0.06、0.08 mL时，脊髓背角CGRP表达与腹壁肌电幅值之间无相关性(P>0.05)。

讨 论

本研究结果提示，粪便滤液灌肠治疗可改善DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织病理学改变、降低腹壁肌电幅值、下调脊髓痛觉相关分子SP表达，说明FMT可改善结肠炎小鼠的内脏敏感性。

FMT因用于治疗艰难梭菌相关性肠炎疗效显著且能改善IBD病情而成为近年研究热点。FMT可使UC患者恢复肠道菌群结构和功能、减轻肠道炎症，甚至可逐渐达到完全性黏膜愈合[13]。现有观点认为疾病的改善与接受FMT后患者肠道细菌组成的长时间改变和粪便混悬液中供者细菌产物的调节作用有关。但也有研究[14]发现经FMT治疗后UC患者肠道菌群的转变与临床症状之间无相关性，提示FMT的作用可能不仅仅是通过改变肠道菌群组成而实现的。

本研究中，DSS诱导的结肠炎小鼠在经粪便滤液灌肠后，DAI和结肠组织病理学评分均较模型对照组改善，提示炎症缓解。CRD实验中，0.02 mL扩张容积下各组间腹壁肌电水平差异无统计学意义，考虑此压力可能尚未达到小鼠疼痛阈值；而在0.04、0.06、0.08 mL 扩张容积下，粪便滤液组腹壁肌电幅值明显低于模型对照组，而与正常对照组无明显差异，说明FMT可降低结肠炎小鼠内脏敏感性。因此，当有适应证的患者进行FMT治疗时，不仅可控制肠道炎症，而且还可通过降低内脏高敏感来减轻疾病活动期或缓解期可能出现的腹痛、腹泻等症状。但本研究的动物模型是急性肠炎模型，急性炎症时因FMT治疗而得到控制的内脏高敏感是否能长期维持尚不明确，仍需行FMT长程疗效的观察研究以明确其是否能对内脏敏感性产生远期影响。

SP是脊髓水平传递伤害性信息的重要神经递质，其升高与炎症引起的腹痛程度密切相关，SP在肠道炎症引起的脊髓背角神经元敏感化中起重要作用[15]。本研究结果显示，经粪便滤液干预治疗后，小鼠结肠炎症减轻，SP表达显著低于模型对照组，且与扩张容积为0.04、0.06、0.08 mL时的腹壁肌电幅值之间存在正相关关系。说明内脏敏感性增高与SP表达水平有关，FMT可降低结肠炎性刺激引起的脊髓背角神经元敏感化，并通过抑制SP释放来阻断痛觉信号的转导。CGRP是外周感觉传入神经元中与SP共存的一种神经肽，不仅可直接产生伤害性作用，还参与炎症诱导的内脏伤害性感觉[16]。本实验中，经灌肠干预后的各组CGRP表达无明显差异，提示FMT可能并非主要通过影响脊髓中CGRP表达来发挥作用；此外，本研究中DSS诱导的结肠炎模型的炎症程度较轻，从而未能引起脊髓背角CGRP表达明显增加，是否更严重的炎症情况下FMT可降低CGRP表达仍有待进一步研究。

双歧杆菌三联活菌胶囊是由双歧杆菌、乳酸杆菌和肠球菌组成的活菌制剂，可补充肠道有益菌，调节肠道微生态平衡以及黏膜免疫功能，抑制有害微生物的生长繁殖。一项meta分析表明，益生菌治疗有益于UC患者的诱导缓解，其维持缓解的效果与5-氨基水杨酸相当[17]。本实验中粪便滤液组和双歧杆菌三联活菌组之间DAI评分、结肠组织病理学评分、腹壁肌电幅值以及腰骶髓SP、CGRP表达均无明显差异，且两组与正常对照组之间亦无明显差异。理论上而言，FMT为原生态肠道菌群重建，效果应优于双歧杆菌三联活菌单独治疗的效果，导致两者疗效无差异可能的原因包括：①本实验中粪便滤液制作技术条件有限，粪便收集过程不能达到理想的无菌、无氧等状态；② 2.0% DSS诱导的小鼠结肠炎模型炎症程度较轻，加之实验周期长，小鼠结肠炎有一定的自愈倾向。

综上所述，本研究中FMT可减轻DSS诱导的结肠炎小鼠肠道炎症，降低腹壁肌电幅值和腰骶髓SP表达。提示FMT具有降低内脏敏感性的作用，这种作用可能与抑制脊髓背角SP表达有关，这为FMT在IBD的治疗中提供了实验基础。