miRNA作为脓毒症及其并发症生物标志物的研究进展

侯 果 余 追

脓毒症是感染引起宿主反应失调，从而导致致命的器官功能障碍。在充分的液体复苏基础上仍需血管活性药物维持平均动脉压≥65mmHg，且乳酸>2mmol/L，即为脓毒症休克[1]。脓毒症已成为全球危重病患者死亡的主要原因，早期识别脓毒症和脓毒症休克对于尽早启动集束化治疗，降低死亡率至关重要。尽管脓毒症的治疗措施越来越完善，然而其住院死亡率仍高达40%[1，2]，这与延迟诊断和治疗密切相关。实验室生物标志物对脓毒症早期诊断、病情评估和预后判断有着重要的临床意义，目前临床使用的生物标志物如C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)和白细胞介素-6 (IL-6)的敏感性和特异性均较低[3]。目前关于miRNA在疾病发生发展中的研究越来越多，有人提出miRNA可以作为一种新的脓毒症生物标志物，本文对近年来关于miRNA在脓毒症方面的研究进展进行综述。

1 miRNA的特性及在临床疾病中的应用

miRNA是一种新的小RNA分子，由长约22个核苷酸构成，属于非编码RNA，不对蛋白质进行编码，而是调节基因的表达。第一个miRNA是20年前在秀丽隐杆线虫中发现的，被称为lin-4，随后在众多的生物体中共发现了数千个miRNA，目前人类基因组中大概有2 588个miRNA。所有miRNA家族都要经历一系列的生物合成过程，从而将miRNA前体转化为具有活性的、成熟的miRNA。miRNA是通过细胞核内RNA聚合酶II作用于miRNA基因而合成，通过转录形成miRNA前体，miRNA前体转录序列在RNase III 核酸内切酶(Drosha)的作用下裂解，进而在细胞核形成miRNA前体，最后通过输出蛋白5转移到细胞质中。一旦进入细胞质，miRNA前体就会被第二种RNase III内切酶(Dicer)和转活化因子RNA结合蛋白(TRBP)裂解，形成成熟的miRNA双链和随从链，最终被Ago2蛋白所降解。这些miRNA在一定的压力条件下由细胞内释放出来，主要是通过两种机制，一种是细胞死亡时的被动释放(凋亡体)，另一种是细胞分泌时的主动释放(外泌体、核糖体复合物、高密度脂蛋白和微泡)[4]。

miRNA具有特异性、选择性和高稳定性的特点，这使它们在医学临床诊断方面具有成为理想的生物标志物的可能。虽然大量的miRNA存在于细胞内，但如前所述，细胞外同样存在着miRNA，称为循环miRNA。细胞外miRNA的基本特征表现为高稳定性和特异性，在一些体液中广泛存在，而体液是最容易获得的生物样本，是分析特定生物标志物的理想材料，如血液(血清和血浆)、唾液、尿液、粪便、滤泡液、滑膜液、胰液、胆汁、胃液，并可作为相关疾病的生物标志物被检测出来[5]。研究表明，不同类型的miRNA与心血管疾病、癌症、中毒、中枢神经系统疾病、代谢紊乱、免疫紊乱、感染和创伤后疾病等密切相关。Mitchell等[6]发现6个miRNA可作为非侵入性方法诊断前列腺癌，分别为miRNA-100、miRNA-125b、miRNA-141、miRNA-143、miRNA-205和miRNA-296。Lin等[7]报道了5个miRNA(miRNA-15b、miRNA-1975、miRNA-199a-3p、miRNA-199b-3p和miRNA-421)可以作为肝癌诊断的生物标志物。Jansen等[8]也在冠状动脉疾病患者中发现了一些表达改变的miRNA: miRNA-126、miRNA-222、miRNA-21、miRNA-20a、miRNA-27a、miRNA-92a、 miRNA-130、miRNA-199a、miRNA-217、miRNA-9na-2a、miRNA-21、miRNA-2a。此外，他们还发现低浓度的miRNA-126和miRNA- 199与降低心血管事件的风险有关。Alieva等[9]在帕金森病miRNA表达研究中发现miRNA-7、miRNA-9-5p、miRNA-9-3p、miRNA-129和miRNA-132表达增加。Izumi等[10]在脊髓损伤的实验模型中检测到损伤12h后miRNA-233异常表达。miRNA-122参与了胆固醇代谢、肝细胞癌和丙型肝炎病毒感染[11]。这些研究为miRNA作为脓毒症生物标志物奠定了一定的基础。

2 miRNA作为脓毒症的标志物

近期研究显示miRNA表达与脓毒症密切相关，不同miRNA在脓毒症中表达也不同。Puimège等[12]在动物试验中证实，miRNA-511能够直接靶向作用于脓毒症炎症反应的主要调控因子肿瘤坏死因子(TNF)而发挥作用，对TNF诱导的脓毒症小鼠注射miRNA-511可以降低TNF受体-1的表达水平，从而减轻炎症反应。而另一项研究[13]表明miR-146a在单核细胞系THP-1的脓毒症细胞模型中通过使TNF-α的转录沉默和翻译中断来减轻炎症反应。miRNA-30a在脂多糖诱导的脓毒症中通过靶向作用于炎症通路STAT1而抑制炎性因子MD-2在单核细胞中的表达[14]。然而，这些研究也仅仅是在动物试验中初步验证了miRNA在脓毒症发病机制中的作用。有一项研究[15]报道了miRNA-25对于脓毒症诊断的临床准确性优于CRP和PCT，miRNA-25下降的程度与脓毒症严重程度、SOFA评分、CRP和PCT水平密切相关。Vasilescu等[16]发现与健康对照组(无感染患者)相比，脓毒症患者血清miRNA-150和miRNA-342-5p水平减少，且血清miRNA-150水平与患者病情严重程度密切相关，提示miRNA-150可以作为脓毒症的一个标志物，同时脓毒症患者血清miRNA-486和miRNA-182水平明显高于健康对照组。Wang等[17]的研究显示，联合脓毒症分期和SOFA评分，miRNA-574-5p对脓毒症患者死亡有一定预测价值，其敏感度为78.13%、特异度为91.84%。以上研究提示miRNA对脓毒症诊断和预后预测均有意义。Puskarich等[18]研究了miRNA-146a、miRNA-223和miRNA-150的表达与脓毒症之间的相关性，同时也证实了miRNA-150的表达与高死亡率相关。Wang 等[19]研究表明脓毒症患者组血清miRNA-223和miRNA-146a表达较健康组低。Huang等[20]鉴定了10个可以作为脓毒症的生物标志物的miRNA:miRNA-7b、miRNA-15b、miRNA-16、miRNA- 210、miRNA-324-3p、miRNA-484、miRNA-486-5p、miRNA-340、miRNA-324-3p。Wang等[21]证实miR-122、miR-193b、 miR-483-5p 和miR-574-5p与脓毒症相关，在对232例脓毒症患者进行miRNA表达检测的研究中发现，miRNA-122可以作为脓毒症的标志物，并且与28天死亡率相关。

一旦诊断为脓毒症，需在1h内尽快给予对致病菌敏感的抗菌药物来控制感染，每延迟一小时，死亡率就会显著增加[2]。因此尽早明确病原菌对治疗脓毒症同样至关重要。尽管微生物培养是目前确定脓毒症患者病原菌的金标准，但阳性率有限，因此可以检测病原菌的特异性miRNA来提高阳性率，并且通过检测细菌感染过程中miRNA表达的变化来确定病原菌的种类。在幽门螺杆菌感染、李斯特菌、结核分枝杆菌和肠道沙门氏菌感染的情况下，miRNA-146和miRNA-155的表达发生了改变，同时确定了miRNA-92a、miRNA-93、miRNA-181b、和miRNA-1981在布鲁氏菌中的表达；铜绿假单胞菌引起的感染也会改变miRNA的表达，尤其是miRNA-302b；大肠埃希菌感染会导致miRNA-30c和miRNA-130a表达上调[22]。How等[23]研究发现革兰氏阴性杆菌引起的泌尿系脓毒症患者miRNA- 150表达下降。而另外一项研究在金黄色葡萄球菌感染的患者中发现了4种特定的miRNA: bta-miRNA-2229、miRNA-499、miRNA-23a和miRNA99b[24]。提示miRNA作为诊断生物标志物可为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性细菌的鉴别提供一个新的思路，同时可进一步明确病原菌，为脓毒症早期抗感染策略提供依据。

3 miRNA作为脓毒症导致器官功能障碍的标志物

3.1 心功能障碍

脓毒症引起的心功能障碍的特征是心肌收缩力受损和心脏射血分数降低，且病理生理学机制尚不清楚，目前还没有特效药物能够预防脓毒症引起的心功能障碍[25]。几项研究显示miRNA在脓毒症导致的心功能障碍中具有潜在作用，例如，miRNA-233被抑制后能促进炎症反应，从而使脓毒症小鼠出现心肌抑制[26]。Wang等[27]也证明了抑制miRNA-155对内毒素诱导的心功能障碍具有保护作用。此外，miRNA-146a可以通过阻止NF-kB(nuclear factor kappaB)激活和减少炎性细胞浸润来减弱脓毒症诱导的心脏功能障碍[28]。另有研究[29]表明脂多糖可以抑制miRNA-499的表达，进而通过Bcl-2(B-cell lymphoma-2)家族凋亡通路促进脓毒症所致的心肌细胞凋亡。因此，这些miRNA有可能成为新的生物标志物，也可能成为干预脓毒症心肌抑制的新靶点。

3.2 肺损伤

急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是脓毒症患者最常见的严重并发症之一，早期识别脓毒症患者可能出现ARDS的风险在治疗中至关重要，目前尚无针对脓毒症导致的ARDS特异性的诊断标志物。miRNA可能参与调控脓毒症诱导的肺损伤，如Ying等[30]发现miRNA-127通过激活JNK通路调节巨噬细胞分化，促进肺炎症反应和损伤。Liu等[31]通过实验证实病毒和细菌性肺部感染所导致的ALI/ARDS可以通过上调miRNA-200c-3p表达，使血管紧张素II水平升高而引起肺损伤。Liu等[32]也通过对脓毒症大鼠不同时间点的血清和肺组织检测发现miRNA-23a-5p可以作为脓毒症导致的ARDS早期阶段的诊断标志物，为ARDS的早期识别提供了一个新的方法。

3.3 肝肾功能障碍

肝肾功能障碍在脓毒症导致的器官功能障碍中同样较常见，有研究[33]证实脓毒症所致的肝肾损害与miRNA变化密切相关。在经盲肠结扎和穿刺的大鼠脓毒症模型中，肝脏和肾脏组织中可检测到miRNA-142-3表达上调，从而降低了肝巨噬细胞中腺苷环化酶9的表达，从而阻止巨噬细胞的促炎反应。Lv等[34]发现miRNA-155抑制剂能够通过增强细胞激酶信号-1(Suppressor of Cytokine Signaling 1，SOCS1)的表达和抑制JAK/STAT信号通道来减轻脓毒症所导致的肝脏损伤。Roderburg等[35]分别对小鼠肝脏缺血再灌注模型和盲肠结扎穿刺脓毒症模型的血清和肝脏进行检测发现miRNA-122均显著升高，且与肝损伤严重程度相关，同时又分别对57例肝硬化和223例危重患者的血清miRNA-122水平进行检测，发现在没有肝脏损伤的肝硬化患者中miRNA-122水平基本上是正常的，而存在肝脏损害的所有患者中其水平明显升高，因此认为miRNA-122水平升高可以作为炎症所致肝脏损伤的一种独立的标志物。Jia等[36]证实将脂多糖诱导的脓毒症小鼠敲除miRNA-21会导致程序性细胞死亡蛋白4上调，细胞凋亡增加，脓毒症诱导的肾损伤也会加重。Colbert等[37]通过miR-223敲除小鼠和多个实验性小鼠脓毒症模型，证实miRNA-223在脓毒症所导致的急性肾损害(AKI)中发挥着重要作用，且在不同的模型中表现不一，在缺乏miRNA-223的情况下，小鼠在脓毒症无菌模型(脂多糖注射)中表现出了严重的AKI，在脓毒症的感染模型(盲肠结扎穿刺)中表现出了轻度的AKI，其具体机制尚未明确。由念珠菌引起的泌尿系脓毒症虽然不常见，但却造成了高死亡率和严重的肾脏损伤，Li等[38]在C57BL/6小鼠腹腔内注射白色念珠菌后发现肾小球滤过率下降，miRNA-204和miRNA-211表达显著降低，而血红素加氧酶1(Heme Oxygenase 1,Hmx1)表达上调，同时也通过实验证实了Hmx1为miRNA-204和miRNA-211的靶向基因，进而发现通过miRNA-204/miRNA-211-Hmx1信号轴可使宿主产生免疫抑制，从而加重肾功能损害。

3.4 凝血功能障碍

血小板减少已成为脓毒症患者最常见的并发症之一，最近的一项研究表明，脓毒症患者血小板减少时，miRNA-130a表达减少，表明miRNA参与了脓毒症相关血小板减少症的病理生理学过程，从而成为一种潜在的生物标志物[39]。此外，Wang等[40]的临床试验表明，脓毒症患者凝血异常组的血清miR-122水平显著高于凝血正常组，在进入重症监护病房后miRNA-122可持续升高至第14天，且与抗凝血酶III相关性较强。然而，目前仍不清楚这些miRNA如何影响凝血功能，需要进一步的研究来确定更多的miRNA作为凝血功能障碍的生物标志物。

3.5 在其它组织器官损害中的作用

脓毒症诱导的内皮细胞活化和损伤部分是由Slit2-Robo4通路介导的，下调miRNA-218的表达能够调节内皮细胞炎症反应[41]。Rajput等[42]发现miRNA-150抑制血管生成素Ⅱ的产生，在修复血管损伤和降低脓毒症死亡率方面起着关键作用。在脓毒症炎症反应中，miRNA-146a/b在内皮细胞中的表达是增加的，通过靶向作用于NF-kB通路促进炎性介质释放[43]。此外，有研究表明miRNA在脓毒症导致的肌病中的发挥着重要作用，在脂多糖诱导的猪脓毒症模型中通过检测骨骼肌发现miRNA-146-5p和miRNA-221-5p显著上调，且miRNA-146a-5p可能通过Toll样受体(Toll-like Receptor,TLR)信号通路负反馈调控炎症性肌肉的分解代谢，miRNA-221-5p的调控机制尚不清楚，需要进一步研究来明确[44]，此研究提示这些miRNA可能参与脓毒症所致的肌肉分解代谢。

4 小结与展望

随着研究的不断深入，miRNA越来越多地被用作诊断生理、代谢和生化功能障碍的生物标志物，大量的miRNA已被证实对脓毒症具有特异性，如miRNA-25、miRNA-150、miRNA-574-5p、miRNA-122、 miRNA-130a等为脓毒症的诊断和治疗提供了一个新的方向。由于相关纳入的样本量少，且为单中心研究，miRNA仍处于研究的初级阶段，临床应用中存在许多问题和挑战，但它们有可能成为脓毒症新的生物标志物的潜力以及新的治疗靶点。因此，需要更多的研究来提高miRNA的敏感度、特异性和选择性，进一步探索脓毒症的炎症激活通路与miRNA的关系及更多组织和器官特异性较强的miRNA，或许对脓毒症的靶向治疗或许更有意义，从而为运用于临床提供更多的科学依据。